Baculovírus recombinantes expressando toxina inseticida de aranha caranguejeira causam morte celular precoce durante infecção in vitro

Abstract

Baculovírus são vírus de DNA dupla-fita circular que infectam insetos principalmente da ordem Lepidoptera. O problema de seu uso como inseticida é o tempo que este leva para matar o inseto hospedeiro. A fim de resolver este problema, inserção de genes inseticidas no genoma viral pode ser requerida. Uma importante fonte de proteínas inseticidas é o veneno de aracnídeos, cujo alvo e ação permanecem pouco elucidados. Assim, promopos o uso de baculovírus como ferramenta para entender mecanismo de ação de peptídeos tóxicos em células de inseto. Diante disso, diferentes versões da toxina putativa BaTx derivada de biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha caranguejeira Brachypelma albiceps foram obtidas por PCR e usadas para construção de baculovírus recombinantes. Os recombinantes foram usados para infecção de duas linhagens de lepidópteros, IPLB-Sf1-AE e BTI-Tn5B1-4 e a viabilidade celular foi avaliada durante a infecção. As diferentes versões da toxina causaram morte celular precoce por necrose em níveis diferenciados. Análise estrutural e ultraestrutural mostraram clara mudança citomorfológica em células, corroborando perda de integridade da membrana plasmática e do conteúdo citoplasmático, permanência do núcleo com carioteca intacta e associada a restos de membranas circundantes. Esta característica criou um aspecto rugoso quando observado em microscopia de luz. Além disso, o gene da toxina BaTx foi expresso em sistema procariótico para obtenção de antisoro policlonal murino. Entretanto, quando testado contra extratos de células infectadas com recombinantes, não houve marcação. Fato este esperado, uma vez que a toxina não foi observada em gel SDS-PAGE. Não há relatos de genes de toxinas de aranha com ação citotóxica clonadas em baculovírus, provavelmente esta característica não permitiu que houvesse acúmulo da toxina em níveis diagnosticáveis por imunomarcação ou pode ter promovido instabilidade peptídica. Peptídeos formadores de canais apresentam alto conteúdo de resíduos básicos (arginina e lisina), de cisteínas e conformação em folha-beta. BaTx apresenta todas estas características, porém alvo e ação permanecem obscuros. Canais tipo-TRP são encontrados em insetos e há indícios da presença desses transportadores na membrana plasmática e em membranas intracelulares. Talvez estes canais possam ser o alvo de ação da toxina BaTx. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Baculoviruses are dsDNA circular virus infectives to insects mainly from the Order Lepidoptera. Its biopesticide use problem is the time of death during insect infection. To solve this problem, insecticide genes can be inserted into the viral genome. An important insectice protein source is the venom of arachinids. However, the target and action of many peptides remain unclear. Baculoviruses can be used as a tool to udersatand the toxic peptides playing in insect cells. Thus, different vesions of a putative toxin were obtained from cDNA library of the tarantula Brachypelma albiceps venom gland by PCR and used to construct recombinant baculoviruses. The recombinants were used to infect two lepidopteran cell lines, IPLB-Sf1-AE and BTITn5B1- 4, and cell viability was evaluated during infection. The toxin versions caused wide and early cell death by necrosis in different levels. Structural and ultrastructural analyses showed clear cytomorphological changes, corroborating loss of the plasma membrane integrity and cytoplasmic contents, and nucleus with intact karyotheca linked with surrounding plasma membrane remains. The features created a rough aspect when those infected cells were observed by light microscopy. Furthermore, the BaTx toxin gene was expressed by a prokaryotic system to obtain murine polyclonal antiserum. However, when the antiserum was tested against infected cells extract with recombinant virus carrying the BaTx toxin no reaction was detected. This observation was expected since the toxin was not observed by SDS-PAGE. There are no reports of spider toxin genes with necrotic action cloned into baculovirus, probably this feature did not allowed toxin accumulation in detectable levels by immunoblot or it could have promoted protein instability. Channel former peptides show high content of basic amino acid residues (lysine and arginine), cystein residues, and beta-sheet conformation. BaTx presents all those features, but its target and mode of action remain unknown. TRP-like channels are found in insects and there is evidence of the presence of these iontransporters in intracellular membranes as well as in plasma membrane. Perhaps TRPlike channels can be the BaTx toxin target of action.