Indentificação e caracterização biológica de peptídeos isolados da peçonha do escorpião comlombiano Tityus pachyurus, que atuam nos canais para Na+

Abstract

Tityus pachyurus é uma das espécies causadoras de escorpionismo grave na Colômbia e pouco se conhece sobre as toxinas que constituem sua peçonha. O presente projeto teve como objetivo principal identificar novas toxinas moduladoras de canais para Na+ na peçonha de T. pachyurus. Pela construção da biblioteca de cDNA da glândula peçonhenta de um escorpião T. pachyurus se identificarem 5 novas toxinas putativas da família dos peptídeos com atividade em canais para Na+ e por similaridade na estrutura primária dos peptídeos maduros, 3 foram classificados como alfa-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 e Tpa6 - e dois como beta- NaScTxs - Tpa7 e Tpa8 -, sendo que a toxina Tpa8 é o primeiro registro de uma beta toxina anti-inseto excitatória na peçonha de escorpiões do Novo Mundo. Essas NaScTxs foram usadas na construção de uma árvore filogenética incluindo NaScTxs do escorpião T. obscurus e de outras identificadas em escorpiões do gênero Tityus e depositadas nos bancos de dados públicos de proteínas. A análise filogenética coincide com a distribuição geográfica dos escorpiões do gênero Tityus divididos nas espécies que ocorrem ao norte do rio Amazonas e naquelas que habitam ao sul do rio Amazonas. A peçonha bruta de T. pachyurus, submetida a fracionamento por RPHPLC usando uma coluna C18, resultou em 55 frações cromatográficas. As três frações mais abundantes foram submetidas a recromatografias e os peptídeos puros obtidos foram seqüenciados por espectrometria de massa (MS). Três seqüências parciais que correspondem a três novas NaScTxs foram obtidas: Tpa9 com 7061,87 Da, Tpa10 com 6994,36 Da e Tpa11 com 7167,23 Da. Essas novas toxinas (500 nM) foram testadas em canais de sódio expressos em células HEK. Tpa9 reduziu em 20% as correntes de Na" em hNavU, como as (3NaScTx.Tpa10 apresentou efeito em hNav1.1, hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6 como as aNaScTx e a Tpa11 em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. A Tpa2, uma (3NaScTx previamente identificada na mesma espécie de escorpião, modificou as correntes de sódio em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. Essas quatro toxinas foram administradas em camundongos via i.p., indicando que Tpa2 e Tpa10 causam escorpionismo classe II (x2= 8,0; p-valor = 0,005) e degeneração vacuolar e infiltrado inflamatório no fígado (x2= 4,4; p-valor = 0,035). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Although Tityus pachyurus is the scorpion species which is responsible for the most dangerous cases of scorpionism in Colombia, little is known about its venom toxins. This project aimed to identify new toxins having Na+ channels as molecular targets in the venom of T. pachyurus. By means of the library construction of the cDNA venomous gland of a scorpion T. pachyurus, five new putative toxins from NaScTx peptide family were identified and by the primary structure of the mature peptides, three of them were classified as alpha-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 and Tpa6 - and two as beta-NaScTxs - the Tpa7 and Tpa8. The last one is the first anti-insect excitatory beta-class toxin describedfor a New World scorpion. These five toxins, together with others NaScTxs described for Tityus species were used to construct a phylogenetic tree. Phylogenetic analysis indicated a marked geographic separation between toxins presented in scorpions occurring in the North of the Amazon River and those presented in the scorpions inhabiting the South of the Amazon River. The crude venom of T. pachyurus after being fractionated by RP-HPLC, using a C18 column, resulted in 55 chromatografic fractions. The three most abundant fractions were submitted to further fractioning and the purified peptides were sequenced by mass spectrometry (MS). Three NaScTxs partial sequences were described: Tpa9 with 7061.87 Da, Tpa10 with 6994.36 Da and Tpa11 with 7167, 23 Da. These new toxins (500 nM) were tested on Na+-channels expressed in HEK cells. Tpa9 reduced on 20% the Na+ currents in hNavl.1, similarly as the (3NaScTxs; Tpa10 acted on hNav1.1, hNavl .2, hNav1.3 and hNav1.6 as aNaScTxs, and Tpa11 had effect on hNavl .2, hNavl .3, and hNavl .6. The Tpa2, a (3-toxin previously identified, modified the currents in hNavl.2, hNavl.3 and hNavl .6. These four toxins were injected into mice showing that Tpa2 and Tpa10 caused class II scorpionism (x2 = 8.0, p = 0.005) and vacuolar degeneration and inflammatory infiltration in the liver (x2 = 4.4, p-value = 0.035).