Estudo do comportamento clínico, efeito de drogas in vitro e identificação de proteínas de Leishmania isoladas de pacientes com Leishmaniose Tegumentar Americana que não responderam ao tratamento

Abstract

No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar Americana constitui um importante problema de saúde pública. É uma doença de difícil controle com aumento de casos que não respondem ao tratamento. Até o momento, não existe terapêutica ideal para as leishmanioses, contudo os antimoniais pentavalentes têm representado a droga de escolha com cura de 60 a 90%, nos últimos anos. A não resposta ao tratamento é complexa com vários fatores envolvidos tais como, a falha terapêutica vinculada à resposta do hospedeiro e a resistência do parasito as drogas. O objetivo deste estudo foi analisar isolados de L.(L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis obtidos de lesão cutânea de portador de Leishmaniose Cutânea Difusa e Leishmaniose Cutânea Mucosa respectivamente com sucessivas falhas terapêuticas, comparados com Leishmanias controles. Os isolados dos pacientes foram estudados em relação a manifestação clínica, a ação de drogas in vitro e a identificação de proteínas. Os testes in vitro foram realizados com formas promastigotas e amatigotas axênicas testadas com antimônio pentavalente, miltefosina, anfotericina B lipossomal, pentoxifilina, itraconazol e alopurinol. As drogas foram distribuídas em placas Elisa de 96 poços em concentrações de 0 até 3000 μg/mL para formas promastigotas e de 0 a 50 μg/mL para formas amastigotas axênicas. A suspensão utilizada foi de 106 para formas promastigotas incubadas por 48 h e de 107 amastigotas/mL incubadas por 24 horas a 37ºC e 5% de CO2 para as formas amastigotas axênicas. Em ambas as formas foi empregado o método colorimétrico, com o Methyl Thiazolyl Blue e a leitura dos testes foi realizada em leitor de placas Elisa (Molecular Devices-Spectra Max, 385 plus - USA) no comprimento de onda de 570nm. As drogas alopurinol e miltefosina apresentaram maior eficácia (p<0,05) frente às formas promastigotas de L.(L.) amazonensis comparadas com o controle. E para as formas amastigotas axênicas da mesma espécie, as drogas anfotericina B lipossomal e miltefosina mostraram redução significativa (p<0,05) do número de parasitos em relação ao controle. Na identificação de proteínas pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência associada a espectrometria de massa, foram identificadas em maior quantidade as proteínas malate dehydrogenase no isolado de L.(L.) amazonensis e as proteínas XIX ATPase alpha subunit Leishmania braziliensis e putative heat shock protein hsp70 Leishmania braziliensis no isolado de L.(V.) braziliensis, indicando possível relação destas proteínas no comportamento da doença. Acredita-se que seja necessária, além da identificação e elevação dos níveis das proteínas, a constatação da super-expressão das mesmas nas populações sensíveis e resistentes das espécies de L.(L.) amazonensis e L.(V.) braziliensis estudadas para explicar melhor a falha terapêutica dos isolados dos pacientes. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

In Brazil, American cutaneous leishmaniasis is an important public health problem. It is a difficult disease to control with an increase in cases no-response to treatment. At the moment, no exist ideal therapy for leishmaniasis, but the pentavalent antimonials have represented the drug of choice to cure 60-90% in recent years. The non-responsiveness to treatment is complex with many factors involved such as therapeutic failure linked to the host response and parasite resistance to drugs. The objective of this study was analyze isolated from L.(L.) amazonensis and L.(V.) braziliensis obtained from patients with diffuse cutaneous leishmaniasis and cutaneous mucosa leishmaniasis respectively with successive therapeutic failures, compared with controls Leishmanias. The isolates of patients were studied in relation to clinical manifestation, the action of drugs in vitro and identification of proteins. The in vitro tests were performed with promastigotes and axenic amatigotas with pentavalent antimony, miltefosine, liposomal amphotericin B, pentoxifylline, itraconazole and allopurinol. The drugs were distributed in 96-well ELISA plates in concentrations ranging from 0 to 3000 mg/mL for promastigotes and 0-50 mg/mL for axenic amastigotes. The suspension used was 106 to forms promastigotes/mL incubated for 48 h and 107 forms amastigotes/mL incubated for 24 hours at 37°C and 5% CO2. In both forms was used the colorimetric method, with Methyl Thiazolyl Blue and reading test was performed in Elisa plate reader (Molecular Devices, Spectra Max 385 plus - USA) at a wavelength of 570nm. The drug allopurinol and miltefosine showed greater efficacy (p <0.05) compared to the promastigotes of L.(L.) amazonensis compared with control. And for the axenic amastigotes of the same species, the drug miltefosine and liposomal amphotericin B showed a significant reduction (p <0.05) of the parasites number when compared to the control. The identification of proteins by the technique of high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry identified in higher quantities the proteins malate dehydrogenase isolated from L.(L.) amazonensis and ATPase alpha subunit Leishmania braziliensis and putative heat shock protein hsp70 in Leishmania braziliensis isolated from L.(V.) braziliensis, indicating a possible relationship of these proteins in disease behavior. It is XXI believed that besides the identification and increased levels of proteins, it is necessary the realization of over-expression of the same in sensitive and resistant populations of the species of L.(L.) amazonensis and L.(V.) braziliensis studied to explain better the treatment failure from patients isolates.