Identificação e análise funcional de sinais de secreção de Pichia pastoris

Abstract

Quase todos os vetores de expressão de Pichia pastoris utilizam a sequência da região pré-pró do fator-α de Saccharomyces cerevisiae como sinal de secreção, o qual pode ser processado incorretamente em condições de hiperexpressão. Utilizar um sinal de secreção nativo de P. pastoris pode contornar este problema, mantendo a estrutura correta da proteína heteróloga. Utilizando o software Signal P. 3.0, os peptídeos sinais de 13 proteínas nativas do secretoma e a região “pré-pró” do fator α putativo de P. pastoris foram identificados e em seguida suas sequências foram amplificadas via PCR. Essas sequências foram clonadas no vetor pPIC9, integradas e expressas nessa levedura, junto com o gene repórter α-amilase de Bacillus subtillis. O fator α de S. cerevisiae presente nesse vetor foi removido, permitindo que apenas as sequências testadas neste trabalho influenciassem a secreção da enzima heteróloga. Após análise dos halos de hidrólise em placa e ensaios enzimáticos utilizando sobrenadante de cultura, observou-se que pelo menos quatro sinais de secreção testados possuíam níveis de secreção semelhantes ao fator α de S. cerevisiae. O sequenciamento do N-terminal da α-amilase será feito por espectrometria de massa, após purificação da enzima em coluna de níquel, e permitirá a análise da eficiência de processamento dos peptídeos sinais testados. Este último teste permitirá a escolha de um novo sinal de secreção nativo de P. pastoris, introduzindo novas opções para expressão heteróloga nesta levedura, além das disponíveis comercialmente pela empresa Invitrogen (EUA). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Almost all Pichia pastoris expression vectors uses Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal, which can be improperly processed in conditions of hiperexpression. Using a native P. pastoris secretion signal should overcome this problem, maintaining the right structure of the heterologous protein. Using Signal P. 3.0 software, 13 secretion signals of native secretome proteins and the putative α factor of P. pastoris were identified and then their sequences were amplified via PCR. These sequences were cloned in pPIC9 vector, integrated and expressed in this yeast, along with a Bacillus subtillis α-amylase gene as a reporter. The S. cerevisiae α factor present in this vector was removed, allowing that only the sequences tested in this work had influence on the secretion of the heterologous enzyme. After analyses of hydrolysis halos on plates and enzymatic assays using culture supernatants, it was observed that at least four secretion signals tested had similar secretion levels of the S. cerevisiae α factor. Sequencing of the N-terminus of α-amylase will be carried out by mass spectrometry, after purification of the enzyme in a nickel based column, and will allow analysis of processing efficiency of the signal peptides tested. The latter test will enable the selection of a new native P. pastoris secretion signal, introducing new options for heterologous expression in this yeast, aside the ones commercially available by Invitrogen Company (USA).