Produção de glucagon recombinante : expressão, purificação e avaliação de atividade biológica

Abstract

De acordo com a Organização Mundial da Saúde – OMS, um terço da população mundial não tem acesso a medicamentos (NWOBIKE, 2006). No Brasil, o Sistema Único de Saúde – SUS disponibiliza a aquisição gratuita destas drogas para a população. Estes fármacos são classificados em três categorias: componentes básicos, componentes estratégicos e componentes especializados da assistência farmacêutica. Dentre estas categorias, esta última se destaca devido aos medicamentos serem de alto custo, importados e utilizados em tratamentos prolongados. O Ministério da Saúde criou em 1993, o Programa de Medicamentos Especializados, anteriormente denominado excepcionais. Este programa fornece fármacos de alto custo e acesso restrito. No primeiro ano, o programa ofereceu 31 apresentações em 15 diferentes itens. Atualmente, a lista de medicamentos oferece 150 itens sob 310 apresentações distintas. O aumento da disponibilidade destes fármacos e a importação dos mesmos acarretaram em uma sobrecarga de gastos ao Ministério da Saúde. Durante o ano de 2011, foram gastos R$ 3 bilhões com estes fármacos. Os componentes especializados incluem fármacos para o tratamento de diversas doenças, tais como hepatites virais, doença de Alzheimer, esclerose múltipla e diabetes. Desde 2008, o fármaco glucagon está incluído na lista deste componente, utilizado principalmente em casos de hipoglicemia em diabéticos. Porém, este fármaco pode ser utilizado para diversas finalidades, como em diagnósticos e emergências hospitalares. Para reduzir o alto custo com estes medicamentos, o Governo Federal criou, em 2004, a Lei de Inovação Tecnológica. De acordo com o decreto número 6.041 de Fevereiro de 2007, foram instituídas a Política Nacional de Biotecnologia e a criação do Comitê Nacional de Biotecnologia, com o desenvolvimento da biotecnologia na área da saúde humana, cujo foco na indústria farmacêutica brasileira foi priorizado. A produção de glucagon pela bioindústria brasileira está inserida neste contexto. Desta forma o objetivo deste trabalho é desenvolver um processo de produção, expressão, purificação e avaliação da atividade biológica de um peptídeo glucagon recombinante. O peptídeo foi expresso em sistema heterólogo usando Escherichia coli, utilizando um vetor de expressão com a tecnologia de fusão do tag GST ao glucagon. A estratégia escolhida visou obter o peptídeo na fração solúvel, o que correspondeu a 50% da expressão total de proteínas na bactéria, na presença de 0,25 mM de IPTG, a 30°C. A purificação ocorreu através de cromatografia de afinidade e o glucagon fusionado foi obtido com 90% de pureza, que posteriormente foi clivado para liberação da fusão utilizando a enzima enteroquinase. A sequência dos primeiros 16 resíduos de aminoácidos, a partir da porção N-terminal, foi obtida por meio de espectrometria de massa e a avaliação da atividade biológica confirmou a atividade do peptídeo. Neste ensaio ratos Wistar hipoglicêmicos foram utilizados para monitorar a glicemia após aplicação de glucagon recombinante, onde o mesmo apresentou desempenho semelhante ao controle positivo (p < 0,00001). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

According to the World Health Organization - WHO, one third of the world population does not have access to therapeutic drugs. In Brazil, the Brazilian National Health System - SUS is the Policy Strategy for Pharmaceutical Assistance, which aiming to make available drugs for the treatment of specific diseases. The pharmaceutical drugs are classified into three categories: basic compounds, strategic compounds and specialized compounds. Among those categories, the last one is special because they present high-cost-drugs, imported and prolonged treatment. In 1993, the Ministry of Health created a program for distributing these drugs to the population for free. In the first year, the program offered 31 presentations in the 15 different drugs. The program includes, nowadays, 150 drugs in 310 presentations. The increased disponibility of these drugs and the import resulted in overhead costs to the Ministry of Health. During the year of 2011, the Brazilian Government spent R$ 3 billion on the acquisition of such therapeutic drugs. Some of the drugs are included in the list of specialized medicines, in order to treating various diseases, such viral hepatitis, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis and diabetes mellitus. The glucagon peptide was added to the list in 2008 aiming to be used in on the control of recurring blood glucose falls in diabetics patients. It can also be used for other purposes, such in diagnostic procedures and emergency rooms. To reduce the high cost on the acquisition of drugs, the Government created the law of technological innovation in 2004. According to the decree 6.041 of February, 2007, in which was instituted the National Biotechnology Policy and created de National Committee of Biotechnology, the development of the Human Health Biotechnology Area, with focus on Biopharmaceutical was priorized. The glucagon production by brazilian industry is inserted in this context. The purpose of this work is the development of a methodology for the production, expression, purification, and evaluation of biological activity of recombinant glucagon. The peptide was expressed in a heterologous system using Escherichia coli. The vector used has a fusion system and GST tag was previously selected to obtain most of the peptide in the soluble fraction, thereby resulting in lower production costs. The expression level obtained was 50% of the total expression of the bacterium, using 0.25 mM IPTG. The purification of the fused peptide was performed on affinity chromatography, showing 90% purity. The partial sequence of the peptide was confirmed by mass spectrometry and the peptide was separated from the fusion using the enzyme enterokinase. In order o confirm the activity of glucagon, a biological assay was done using hypoglycemic Wistar rats, whose blood glucose was monitored after application of recombinant glucagon. The test confirmed the activity of the peptide (p < 0,00001).