Interferência de RNA direcionada ao canal de potássio Eag1 : efeitos sobre a expressão gênica e viabilidade celular do glioma

Abstract

Gliomas representam o tipo de tumor cerebral primário de maior malignidade. Entre as alterações que conferem competência tumoral ao glioma, está o aumento na expressão do canal de potássio hEag1. Na última década, a interferência de RNA (RNAi) tem se destacado como técnica para estudo da função de genes em mamíferos, via silenciamento gênico pós-transcricional. Neste sentido, a técnica de RNAi foi utilizada no atual estudo para silenciar o gene Eag1 em células de glioma. Na primeira etapa deste projeto, foram identificados alvos para RNAi na região codante do gene hEag1 (NM_172362.2), via algoritmo baseado em redes neurais artificiais. Foram identificados 25 alvos de RNAi, com escores variando de 0,82 a 0,87, e selecionados para o atual estudo os dois alvos com maiores escores. Foi realizada síntese química de siRNAs para estes alvos situados nos exons 2 e 8, daí a denominação e2_hEag1 e e8_hEag1. Também foram sintetizados o siRNA controle positivo descrito anteriormente Kv10.1-3 e o controle negativo scramble (Qiagen). Foi inicialmente determinado o ponto temporal (4h, 8h, ou 48h) e a concentração (18,75 nM, 37,5 nM ou 75,0 nM) de maior silenciamento de hEag1, utilizando-se os siRNAs controles transfectados em lipossomas catiônicos. O maior silenciamento foi observado no tempo de 8h pós-transfecção, na menor dosagem testada, 18,75 nM. Nesta condição experimental, foi testado o grau de silenciamento de Eag1 causado pelos dois novos siRNAs, em comparação com o controle positivo Kv10.1-3. Ambos siRNAs desenhados no atual estudo -e2_hEag1 e e8_hEag1 -foram mais efetivos que o controle positivo Kv10.1-3, reduzindo assim o conteúdo relativo de hEag1 em 0,46 vezes e 0,52 vezes, respectivamente, em relação ao valor obtido no controle negativo scramble (p < 0,05). Na última etapa deste estudo, foi avaliado se vetores de expressão de short hairpins RNAs (shRNA) direcionados ao alvo 5´ GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´ do controle positivo Kv10.1-3 (pKv10.1-3hum_LI), causariam alteração de fenótipo celular, ou seja, redução da viabilidade dos gliomas. O efeito destes vetores de expressão (pKv10.1-3hum_LI ou pScramble, dose de 0,2 µg) sobre a viabilidade de gliomas, em uso isolado ou em combinação com interferon gama (IFN-y, 25 ng/mL ) foi testado pelo ensaio de MTT. A redução de viabilidade obtida com a combinação do vetor pKv10.1-3hum_LI e IFN-y (40,4 %)foi superior àquela obtida com o uso isolado de ambos, 16,0% e 11,4%, nesta ordem (p < 0,05). Este efeito sinérgico não foi observado com o vetor controle negativo pScramble, o que indica tratar-se de efeito sequência-específico, ou seja, dependente da sequência do shRNA expresso pelo vetor pKv10.1-3hum_LI. Em síntese, o presente estudo mostra que é possível silenciar a expressão de hEag1 de gliomas via siRNAs sintéticos. Além disto, revela a importância de hEag1 para a viabilidade celular do glioma, principalmente durante a injúria por IFN-y. No sentido tecnológico, o atual estudo apresenta um protocolo inovador com potencial uso na terapêutica de gliomas, baseado na associação de RNAi sobre hEag1 com o agente imunomodulador IFN-y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Glioma is the most common type of primary malignant brain tumor. The disease presents poor clinical outcome and the treatment is essentially palliative. Among the genetic changes that confer capability to tumor cells is the hEag1 gene overexpression. RNA interference (RNAi) has rapidly advanced into a practical technique for mammalian gene function studies, through post-transcriptional genetic silencing. The technique was used in the present study to silence hEag1 gene in glioma cells in culture. We first identified RNAi targets in the coding region of hEag1 (NM_172362.2) by using algorithms based on artificial neural networks. Twenty-five hEag1 RNAi targets were found, with scores ranging from 0.82 to 0.87; the two highest rated were selected. They were chemically synthesized as short interfering RNAs (siRNAs), and designated e2_hEag1 and e8_hEag1, according to the targeted exon. Positive and negative siRNA controls were the previously published Kv10.1-3, and the scramble All Star (Qiagen), respectively. We first determined the time-point (4h, 8h, or 48h) and siRNA concentration (18.75 nM, 37.5 nM, or 75.0 nM) that provide the highest silencing effect, by using RT-qPCR. The best hEag1 knock-down occurred at 8h post-transfection with 18.75 nM siRNA concentration. We used this experimental condition to compare the two new siRNAs - e2_hEag1 and e8_hEag1 – with the positive control Kv10.1-3. Both siRNAs in test produced higher silencing effects compared to Kv10.1-3 (p < 0.05). The mRNA fold decrease varied from 0.46 to 0.52, according to each transfected siRNA e2_hEag1 or e8_hEag1, respectively. Finally, we evaluated whether an expressed short hairpin RNA (shRNA) to the same hEag1 Kv10.1-3 target sequence (5´- GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´) would decrease the glioma cell viability. The expression vectors (pKv10.1-3hum_LI or a scramble control one pScramble, dose 0.2 µg) were transfected into glioma cells, with or without interferon gamma concurrent treatment (IFN- y, 25 ng/mL ) viability was determined by MTT assay. The association of the vector pKv10.1-3hum_LI and IFN- y decreased the glioma cell viability to 40.4%, which surpassed the results obtained from their isolate use, 16.0% and 11.4%, respectively (p<0.05). As pScramble showed no synergism with IFN- y we consider the pKv10.1-3hum_LI effects were sequence-specific. In conclusion, this study showed the ability of two unpublished siRNAs to knock-down hEag1. Our results are in agreement with previous data that established a role for Eag1 in the tumor cell viability. This role seems to be even more important during IFN-y injury. Regarding to biotechnology, this study presents an innovative treatment able to reduce the glioma cell viability, based on the association of shRNA expression vector to hEag1 and the immunomodulatory agent IFN- y.