Avaliação da atividade biológica de proteínas de defesa vegetal expressas em sistemas heterólogos

Abstract

Vários sistemas para expressão de proteínas estão disponíveis para a produção dessas macromoléculas em quantidades necessárias para sua caracterização estrutural ou da sua atividade biológica. São considerados importantes ferramentas biotecnológicas com a finalidade científica, clínica e industrial. Nesse contexto, surge o termo expressão heteróloga caracterizando a produção de uma determinada ou um conjunto de proteínas em sistemas biológicos diferentes do sistema original. Neste trabalho foram avaliados o potencial de proteínas recombinantes para o controle de insetos-praga e fitopatógenos de interesse agronómico. Inicialmente, a expressão de inibidores de α-amilase recombinantes produzidos em plantas de Arabidopsis thaliana foi analisada. O nível de expressão dos inibidores AIC3, AIA11 e AIG4 observado foi de ≈ 0,2-0,3% das proteínas totais solúveis de folha de plantas geneticamente modificadas. Em relação as suas atividades biológicas, na concentração de ≈35 nM foi possível reduzir significativamente a atividade enzimática de α-amilases intestinais do bicudo do algodoeiro, Anthonomus grandis, a molécula utilizada previamente para seleção dos inibidores por phage display. Estes resultados demonstram o potencial das moléculas recombinantes para o controle do bicudo do algodoeiro, importante inseto-praga para a cultura do algodoeiro. No mesmo sentido, em relação aos fitopatógenos, as defensinas vegetais DRR230a de ervilha e SD2 de girasol foram expressas na levedura Pichia pastoris. A produção das proteínas recombinantes foi de 3,5 e 3 mg/l, respectivamente. Após a purificação em coluna de Ni (His Trap FF Crude) das defensinas recombinantes suas atividades antifúngica e antibacteriana foram avaliadas. As proteínas foram capazes de inhibir o desenvolvimento das hifas dos fungos fitopatôgenicos testados (Collethotricum gossypii var cephalosporioides e Fusarium solani sp. glycine) em diferentes níveis, entretanto, apenas a rDRR230a foi capaz de inibir a germinação de esporos fúngicos. Ainda, esta molécula reduziu o crescimento de bacterias Gram negativas e positiva. Conjuntamente, estes dados demonstram o potencial de proteínas de defesa vegetal recombinantes para o controle de insetos-praga e patógenos de importância agronômica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

In this work was evaluated the potential of recombinant proteins in the control of insect pests and pathogens. To produce proteins for biochemical characterizations various protein expression systems has been developed. These are biotechnological tools applied in scientific, clinical and industrial field. In this context, the term heterologous expression characterize protein production in a different system the parental system. Here, the α-amylase recombinant inhibitors were expressed Arabidopsis thaliana plants. The expression level of inhibitors AIC3, AIA11 and AIG4 was ≈0.2-0.3% of leaf total soluble proteins. The inhibitors were able to reduce α-amylase activity of cotton boll weevil, Anthonomus grandis, enzyme activity in low concentration (35 nM). The cotton boll weevil α-amylase was previously used as bait to selection inhibitors by phage display from combinatorial library. The results show the possible inhibitors effectiveness against cotton boll weevil, very important cotton crop insect-pest. Likewise, defensins from pea (DRR230a) and sunflower (SD2) were expressed in yeast Pichia pastoris and the recovery proteins reached 3,5 and 3 mg per culture liter, respectively. The recombinant defensins were purified by nickel column (His Trap FF Crude) and assay against fungi and bacteria were done. The hyphal growth of Collethotricum gossypii var cephalosporioides and Fusarium solani sp. glycine was arrested by two defensins in different level. The rDRR230a was able to inhibit fungi spores germination, otherwise, rSD2 was not able. Yet, the Gram negative and positive grow was controlled by rDRR230. In this regard, rDRR230a is a antimicrobial peptide (AMP) and rSD2 antifungal peptide (AFP). Together, the results show the potential use of recombinant α-amylase inhibitor or plant defensins on management insect-pest and pathogens by crops genetic modification.