O papel das enzimas quitinase e catepsina na patologia viral de baculovírus

Abstract

O Brasil destaca-se por ser um dos maiores exportadores de produtos agrícolas no mundo e diante dessa realidade a utilização de agrotóxicos impacta tanto o meio ambiente quanto a saúde pública. Uma alternativa a essa prática é a utilização de agentes biológicos no controle de pragas. Um exemplo é a utilização do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) no controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, sendo o maior exemplo mundial de sucesso de um vírus utilizado como bioinseticida. Os baculovírus são vírus de DNA fita dupla, específicos de artrópodes. Uma das características apresentada no genoma viral do isolado AgMNPV-2D está na ausência dos genes quitinase (chiA) e catepsina (v-cath). Essa ausência pode ser responsável por não ocorrer a liquefação e a melanização das larvas de A. gemmatalis mortas pela infecção com o AgMNPV-2D. O capítulo I do presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito da expressão dessas proteínas em insetos infectados com AgMNPV recombinantes contendo esses genes derivados de dois baculovírus (Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus - CfDefNPV e Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus - AcMNPV). O vírus recombinante, contendo os genes chiA e v-cath provenientes do baculovírus CfDefNPV, (vAgp2100Cf.chiA/v-cath) foi capaz de promover a liquefação e melanização do corpo das larvas de A. gemmatalis após a morte das mesmas, entretanto, o vírus vAgp2100Ac.chiA/v-cath, construído neste trabalho, não teve o mesmo efeito. Bioensaios com larvas neonatas e de terceiro instar de A. gemmatalis infectadas com o vírus recombinante vAgp2100Cf.chiA/v-cath apresentaram uma maior atividade inseticida. A CL 50 do vírus recombinante foi de 3 (para larvas neonatas) a 4 vezes (para larvas de 3º estágio) menor do que a CL 50 do vírus selvagem. A expressão dos genes chiA e v-cath durante a infecção de células de inseto pelo vírus recombinante foi analisada por qPCR e detectou a presença e aumento de transcritos dos genes a partir de 6 h até 72 h p.i. Outro exemplo à prática de utilização de agentes biológicos no controle de inseto-praga destaca-se o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. O capítulo II do presente trabalho propôs avaliar se a expressão de enzimas quitinase do fungo durante a infecção do vírus é capaz de aumentar a patogenicidade viral em larvas de Spodoptera frugiperda. Foi construído um vírus recombinante inserindo o gene de uma quitinase (chi2) do fungo entomopatogênico M. anisopliae no genoma do vírus AcMNPV, para avaliar o efeito da expressão heteróloga na patogenicidade do vírus recombinante. A CL 50 apresentada pelo vírus recombinante sugere um aumento na virulência quando comparado com o vírus selvagem e a quantidade de enzima detectada também apresentou maiores níveis em células de inseto infectadas com o vírus recombinante comparado ao vírus selvagem. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Brazil stands out for being one of the largest exporters of agricultural products in the world, therefore the use of pesticides impacts on both the environment and public health. An alternative to this practice is the use of biological agents to control pests. An example is the use of baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) in the control of velvetbean caterpillar, A. gemmatalis, which is the greatest global example of successfully using a virus as a bio-insecticide. Baculoviruses are arthropod-specific double-stranded DNA viruses. One of the interesting features of the AgMNPV-2D isolateviral genome is the absence of chitinase (chiA) and cathepsin (v- cath) genes. This absence can be responsible for the lack of liquefaction and larval melanization in A. gemmatalis killed by AgMNPV-2D infection. Chapter I of this study intended to analyze the effect of these proteins expression in insects infected by recombinant AgMNPV containing these genes derived from two baculovirus (Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus - CfDefNPV e Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus - AcMNPV). The recombinant viruses containing the genes v-cath and chiA from the baculovirus CfDefNPV (vAgp2100Cf.chiA/v-cath) was able to promote the liquefaction and melanization of A. gemmatalis larvae bodies after their death, although the vAgp2100Ac.chiA/v-cath virus prepared in this study, did not present the same effect. Bioassays with third-instar neonate larvae of A. gemmatalis infected with the vAgp2100Cf.chiA/v-cath recombinant virus showed higher insecticidal activity. The LC 50 of the recombinant virus was from 3 (for neonate larvae) to 4 times (for 3rd larval stage) lower than the LC 50 of the wild-type virus. The expression of v-cath and chiA genes during infection of insect cells by the recombinant virus was analyzed by qPCR, which detected both the presence and the increase of gene transcripts from 6 h to 72 h p.i. Another noteworthy example of the practical use of biological agents to control insect pest is the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Chapter II of this study aimed to assess whether the expression of fungal chitinase enzymes during viral infection is able to increase viral pathogenicity in larvae of Spodoptera frugiperda. Constructs was made inserting a chitinase gene (chi2) from the entomopathogenic fungus M. anisopliae into the genome of AcMNPV virus, in order to evaluate the effect of heterologous expression in the recombinant virus pathogenicity. The LC 50 presented by the recombinant virus suggests an increase in virulence when compared to wild type virus and the amount of enzyme also showed the highest levels detected in insect cells infected with recombinant virus compared to wild virus.