Bioprospecção de lipases a partir de metagenoma do solo e sua aplicação para a produção de biodiesel

Abstract

O solo do Cerrado brasileiro tem sido o foco de poucos estudos sobre sua diversidade microbiana. O solo é um habitat com uma grande diversidade de microrganismos e, assim, ele pode ser usado como uma fonte de enzimas industriais. A identificação de novos genes através da abordagem metagenômica, trouxe vantagens ao desenvolvimento de enzimas com novas atividades. Lipases são um importante grupo de enzimas com várias aplicações biotecnológicas nas industrias de detergente, alimentos, indústrias farmacêuticas e de biocombustível. Para isolar os genes putativos de lipase com tamanho pequeno de DNA (8 kb), foi realizado screening na biblioteca metagenômica de solo de cerrado com substrado de tributirina. A triagem funcional desta biblioteca resultou na identificação de três clones com actividade lipolitica, que foram devidamente sequenciados. Eles revelaram 4 ORFs com funções relacionadas à atividade lipolítica. Duas das enzimas lipolíticas isoladas da biblioteca de pequenos fragmentos de solo de Cerrado tiveram a sua expressão induzida em E. coli BL21 (DE3), sendo nomeadas LipWorfW e LipYorfY. As ORFs tem 1000 pb e codificam para 2 proteínas contendo 300 resíduos de aminoácidos com um peso molecular estimado de 30 kDa para a proteína LipWorfW e 33 kDa para a proteína LipYorfY e identidade com lipases verdadeiras. Resultado de gel de eletroforese SDS- PAGE demonstram a superexpressão destas enzimas. A determinação de sua atividade ideal e os parâmetros enzimáticos vao levar a uma análise bioquímica detalhada a fim de propor a utilização deste produto em aplicações de biodiesel, com foco na melhoria dos processos de produção. Considerando a aplicação potencial biotecnológico destas enzimas, este trabalho visa a seleção e caracterização de lipases três novos genes da biblioteca metagenômica de solo da savana vegetação adequadas para uso na produção de biodiesel. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Brazilian Cerrado soil has been the focus of very few studies about its microbial diversity. Soil is a habitat with high diversity of microorganisms and thus it can be used as a source of industrial enzymes. The identification of new genes through the metagenomic approach led to the development novel enzyme activities. The advantage of directly screening for enzymatic activities from metagenome libraries is that researchers access previously unknown genes and their encoded enzymes. Lipases are an important group of relevant enzymes as they find immense biotechnologically applications in food, detergent, pharmaceutical and biofuel industries. Lipases are mainly produced by microbes, more frequently bacterial, and play a vital role in commercial ventures. To isolate putative lipase genes a small DNA size (8 Kb), Cerrado soil metagenomic libraries were screened with tributirin. The funcional screening of this library resulted in the identification of three lipase activity producing clones that were subsequently sequenced. They revealed 4 ORFs with functions related to lypolitic activity. Two lipolytic enzymes from the small DNA fragments library of Cerrado soil was isolated and their expression induced in E. coli strain BL21 (DE3), being named LipWorfW and LipYorfY. The open reading frame have 1000 pb and encodes a protein containing 300 amino acid residues with estimated molecular weight of 30 kDa for the LipWorfW protein and 33 kDa for the LipYorfY protein and strong identity with true lipases. SDS-PAGE gel electrophoresis demonstrates the overexpression of that lipase on inducing conditions. The determination of their optimal activity and enzymatic parameters will lead to more detailed biochemical analysis, in order to propose the use of this product in biodiesel applications, with focus on improvement of production processes. Considering the potential biotechnological application of these enzymes, this work aims at the selection and characterization of 3 novel lipases genes from metagenomic library from soil from savannah-like vegetation suitable for use in biodiesel production.