Análise estrutural dos promotores dos genes de endoglicanase egl1 e egl4 de Humicola grisea var. thermoidea

Abstract

A limitação de recursos fósseis e o contínuo crescimento econômico tem aumentado a demanda por fontes alternativas para a produção de biocombustíveis e compostos químicos. A conversão da biomassa vegetal apresenta grande potencial para esse fim, já que representa a maior fonte renovável do planeta. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea (Hgvt) é conhecido por produzir uma ampla variedade de enzimas hidrolíticas termoestáveis. Dentre as hidrolases produzidas por esse organismo estão as celulases, xilanases, glicoamilases e trealases. Tais enzimas possuem grande potencial biotecnológico para a conversão de resíduos agroindustriais em produtos de maior valor agregado tais como ração animal, adubo, biocombustíveis, além de extração de óleos vegetais, processamento têxtil, branqueamento e reciclagem de papéis. A caracterização e a compreensão dos mecanismos regulatórios dos genes que codificam enzimas hidrolíticas são de grande importância para o aprimoramento de estratégias de produção dessas enzimas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo a análise estrutural das regiões 5´ não codificadoras a montante dos genes de endoglicanase 1 (egl1), endoglicanase 4 (egl4) e celobiohidrolase 1.1 (cbh1.1) de Hgvt. As regiões 5´UP foram amplificadas a partir de DNA genômico de Hgvt e clonadas no vetor pGOX, contendo marca de resistência à higromicina B e o cassete de expressão do gene de glicose oxidase (goxA) de Aspergillus niger como repórter visando a posterior caracterização funcional em sistema heterólogo de Aspergillus nidulans. As regiões promotoras de egl1 e egl4 foram inicialmente analisadas in silico quanto à presença de sítios de ligação para os fatores transcricionais PacC, regulador da expressão gênica em resposta ao pH, e CreA, mediador da repressão transcricional por glicose. A fim de se avaliar a interação desses fatores com os promotores foram sintetizadas sondas contendo sítios de ligação para CreA e para PacC. Os domínios de ligação de PacC e CreA foram produzidos em Escherichia coli como proteínas de fusão à glutationa-S-transferase (GST). As proteínas recombinantes e as sondas foram empregadas em ensaios de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA). Foi observada a formação de complexos específicos entre DNA e proteína em dois sítios para PacC e em dois sítios para CreA presentes na região promotora de egl1, o que aponta para a participação desses fatores na regulação do gene. Com relação ao gene egl4, não foi observada a interação entre o fator transcricional PacC e a região promotora do gene. Entretanto, houve formação de complexos entre CreA e os sítios presentes na região 5’UP de egl4. Apesar de reconhecerem os sítios consenso na região desse gene, nenhuma das interações mostrou ser específica. Tais dados sugerem que a regulação da expressão de egl4 obedeça a mecanismos distintos aos dos demais genes de celulase de Hgvt estudados até o momento. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Fossil fuels limited supply and the continuous economic growth have shifted the demand for renewable sources for the production of biofuels and other biomaterials. Plant biomass conversion depicts an interesting potential to this goal, since it represents the most abundant and renewable energy source on the planet. The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea (Hgvt) is well known for its capability to generate thermostable hydrolytic enzymes, such as cellulases, xylanases, glucoamylases and trehalases. These enzymes have great biotechnological potential to convert bio-based feedstocks into products with a higher added value, for instance: animal feed, fertilizers, biofuels and also for the extraction of vegetable oils, textiles processing (biopolishing and biostoning) and paper recycling. Comprehension and characterization of the regulatory mechanisms of hydrolytic enzyme-encoding genes are of great importance to the optimization of these enzymes production. Therefore, the present work aimed the analysis of the 5’ upstream regions of the Hgvt endoglucanase 1 (egl1), endoglucanase 4 (egl4) and cellobiohydrolase 1.1 (cbh 1.1) genes. These regions were obtained from Hgvt genomic DNA and cloned into the pGOX vector. This cloning vector contains a hygromycin selection marker and an Aspergillus niger glucose oxidase (goxA) expression cassette for posterior functional characterization in the Aspergillus nidulans heterologous system expression. egl1 and egl4 genes promoters were analyzed in silico for the presence of binding sites for the pH-responsive transcriptional factor PacC and for the catabolite repressor transcriptional factor CreA. In order to assess the interaction of these factors with the gene promoters, DNA probes containing CreA or PacC binding sites were utilized. PacC and CreA DNA binding domains were produced in Escherichia coli as a glutathione-S-transferase (GST) fusion protein. The recombinant proteins and DNA probes interaction was investigated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). DNA/protein specific interactions were observed between two PacC and two CreA binding sites situated on egl1 promoter region indicating that this gene expression is regulated by pH and by carbon source. Regarding the egl4 promoter, no interaction was detected with PacC. On the other hand, CreA/DNA complexes were detected for the egl4 5’ upstream region but none of these interactions showed to be specific thus suggesting that this gene is subject to an alternative regulatory mechanism.