Caracterização de um promotor pólen-específico da família AP2/ERF de mamona (Ricinus communis L.)

Abstract

Os fatores de transcrição (TF) chamados de DREB pertencem à grande família AP2/ERF e tem envolvimento em interações proteína-proteína e ligação com o DNA. As proteínas AP2/ERF têm funções importantes na regulação da transcrição de genes de uma grande variedade de processos biológicos relacionados com o crescimento e desenvolvimento, bem como várias respostas a estímulos ambientais, regulando a expressão de genes vegetais que respondem a estresses bióticos e abióticos. Neste estudo, um fator de transcrição AP2/ERF (chamado de RcDREB1) foi isolado de mamona (Ricinus communis L.) e sua a expressão foi analisada em sementes em desenvolvimento, folhas, caules e flores (sépalas, anteras e ovários) de plantas cultivadas sob condições de campo. Os transcritos foram detectados em grãos de pólen, com um pico durante a antese. A sequência de aminoácidos do RcDREB1 foi comparada com outras proteínas AP2/ERF TF e apresentou identidade de 38-78%. A análise filogenética resultou na classificação desse gene como um membro da subfamília CBF/DREB, sendo enraizado juntamente com genes do subgrupo A-5. O promotor RcDREB1 foi fusionado com o gene repórter gus e utilizado para transformar tabaco (Nicotiana tabacum L.) por Agrobacterium tumefaciens. As plantas transgênicas foram submetidas a vários tratamentos de estresse abiótico (temperaturas baixas e elevadas, seca, salinidade e ABA exógeno) e nenhuma expressão de GUS foi detectada, sugerindo que o promotor RcDREB1 não é ativo nas condições testadas. As análises in silico revelaram a presença de três cópias do elemento regulador pólen-específico (AGAAA) na região 5' do RcDREB1. A expressão de GUS foi observada somente em grãos de pólen, começando durante a abertura da flor e permanecendo no início do processo de senescência, no qual, grãos de pólen maduros são liberados das anteras. Além disso, os grãos de pólen desidratados também expressaram o gene gus. Este é o primeiro estudo sobre um gene DREB apresentando expressão pólen-específica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

DREB transcription factors (TF) belong to the superfamily of AP2/ERF and their involvement in protein-protein interactions and DNA binding has been proposed. AP2/ERF proteins have important functions in the transcriptional regulation of a variety of biological processes related to growth and development, as well as various responses to environmental stimuli, regulating expression of plant biotic and abiotic stress-responsive genes. In this study an transcription factor AP2/ERF (named RcDREB1) was isolated from castor bean (Ricinus communis L.) and its expression was analyzed in developing seeds, leaves, stems and flowers (sepals, anthers and ovaries) of plants cultivated under field conditions. Transcripts were only observed in pollen grains, peaking during anthesis. The RcDREB1 deduced amino acid sequence was compared to other AP2/ERF TF proteins and presented 38–78% identity. Phylogenetic analysis classified it as a member of the CBF/DREB subfamily, rooting with the subgroup A-5. The RcDREB1 promoter was fused to the gus reporter gene and used to transform tobacco (Nicotiana tabacum L.) using Agrobacterium tumefaciens. Transgenic plants were exposed to various abiotic stress treatments (low and high temperatures, drought, salinity and exogenous ABA) and no detectable GUS expression was observed, suggesting that the RcDREB1 promoter is not active under tested conditions. In silico analyses revealed the presence of three copies of the regulatory late pollen-specific element (AGAAA) in the RcDREB1 5´-region. GUS expression was only observed in pollen grains, starting when the flower opened and initiating the senescence process; at this point, desiccated mature pollen grains are released from anthers. In addition, dehydrated developing pollen grains also expressed the gus gene. This is the first study on a DREB gene presenting pollen-specific expression.