Estudos estruturais da cromatina : ação do colesterol e obtenção do complexo receptor nuclear : nucleossomo

Abstract

O DNA em seres eucarióticos é organizado na forma de cromatina, sendo esta a principal responsável por regular diversas atividades vitais para célula, como o processo transcricional e a manutenção do genoma. A cromatina é um complexo formado por unidades repetitivas de nucleossomos e pode se apresentar na forma aberta (10nm-permissiva) ou fechada (30nm-repressiva). Está evidente que a dinâmica de modulação da estrutura da cromatina determina a resposta transcricional e consequentemente clínica. Neste trabalho, os objetivos foram: i) estudar a ação do colesterol, um agente desidratante e importante molécula sinalizadora, sobre a arquitetura da fibra de cromatina e ii) estabelecer uma metodologia para obtenção do complexo de Receptor nuclear:mononucleossomo. Observamos, por ensaios bioquímicos e imagens de microscopia eletrônica de transmissão, que o colesterol auxilia a formação de fibras de cromatina de 10 e 30nm reconstituídas in vitro, por direcionar as histonas para interação com o DNA. Entretanto, o colesterol afetou a estabilidade de longas fibras de cromatina. Acreditamos que a alteração da estequiometria das moléculas de água com o nucleossomo, causada pela presença do colesterol, possa ter grande impacto na arquitetura da cromatina e que estes resultados obtidos in vitro sirvam de ponto de partida para novas investigações dentro do contexto celular. Na segunda parte, realizamos uma revisão bibliográfica sobre a ação dos RNs no contexto da cromatina, iniciando a construção de clones, contendo elementos responsivos à RNs com o DNA 601, de forte posicionamento de nucleossomos. Também, preparamos um fragmento de DNA 601 para início das reconstituições de mononucleossomo. Estes resultados irão ajudar a implementação de metodologias para estudos in vitro das interações de RNs a nucleossomos e cromatina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The genome in eukaryotes is organized into chromatin, which is the main responsible for regulating many vital cell activities, such as the transcriptional process and the maintenance of genome. It is clear that the local chromatin state open (10nm fiber- permissive) or close (30nm fiber - repressive), regulates the access of transcription factors, co-regulators and basic transcription machinery to specific enhancers in target genes. Thus, it seems obvious that the dynamic modulation of the chromatin structure determines transcriptional and clinical outcome. Herein, we aimed: i) to study the action of cholesterol, a dehydrating agent and an important signalling molecule, on the architecture of the chromatin fiber and ii) to establish a methodology for obtaining the complex Nuclear Receptor: nucleosome. We aimed to dissect the role of the water and electrostatic forces on the three dimensional structure of the first level of folding of nucleosome arrays and the higher order structure of chromatin. By comparing long chromatin fibers reconstituted in vitro, in presence and in absence of cholesterol, we observed that cholesterol improves the 10 and 30nm fibers formation by freeing the highly basic histone octamers to interact with the highly negative DNA. However, by thermo-denaturation assays, cholesterol showed to severely affect chromatin fibers stability. These observations suggest that disturbing the water stoichiometry of a chromatin fiber may have a great impact on chromatin architecture. Moreover, these results can be seen as a start point to investigate the effect of cholesterol in vivo as a potential chromatin remodeler. In the second part, I conducted a literature review on the action of RNs in a chromatin context. We also initiated the construction of clones containing responsive elements to RNs with DNA 601that has strong positioning of nucleosomes. Besides that, we prepared a DNA array for nucleosomes reconstitutions in vitro. These results will help to establish a new methodology for in vitro studies of RNs interaction to nucleosomes and chromatin.