Diagnose molecular do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola

Abstract

A bactéria Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, agente do cancro bacteriano da videira, foi relatada pela primeira vez nas áreas irrigadas do Submédio do Vale São Francisco em Petrolina, Pernambuco, em 1998. A doença também foi identificada em Juazeiro, Bahia, e posteriormente no Piauí, no Ceará, Roraima e Goiás. O uso de material propagativo livre do patógeno tornou-se uma preocupação, uma vez que a ocorrência da bacteriose ainda esta restrita a essas regiões no país e existe o risco de disseminação para outras regiões produtoras no sul e sudeste do Brasil. Com o objetivo de desenvolver um método molecular para detecção e identificação dessa bactéria, três oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base no seqüenciamento parcial do gene hrpB. As combinações de iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foram testados quanto à especificidade e sensibilidade para detecção do DNA de X. campestris pv. viticola. Com os dois pares de iniciadores, a amplificação foi positiva com o DNA das 44 estirpes de X. campestris pv. viticola testados, com quatro estirpes da patovar mangiferaeindicae, e cinco estirpes de X. axonopodis pv. passiflorae. Contudo, a digestão dos produtos de PCR com HaeIII permitiu diferenciar as estirpes das três patovares. Nenhum dos dois pares de iniciadores amplificou o DNA de videira, de 20 bactérias não patogênicas da flora da videira, e de nove estirpes de outros sete gêneros de bactérias fitopatogênicas. A sensibilidade dos iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foi de 10 pg e 1 pg de DNA purificado de X. campestris pv. viticola, respectivamente. O limiar de detecção de RST2/Xcv3R foi de 104 UFC/ml, mas empregando-se um segundo ciclo de amplificação com o iniciador interno Xcv1F, esse limiar foi reduzido para 102 UFC/ml. Os iniciadores foram testados na detecção da bactéria em pecíolos inoculados com a estirpe UnB 1186 e embora não se tenha tido sucesso na PCR com o extrato do macerado do tecido sintomático, foi possível detectar o patógeno usando-se lavado de placas após o crescimento por 72 h ou a partir de uma única colônia diluída em 200 􀈝l de água. A identidade da bactéria foi confirmada pela análise de RFLP, que gerou o padrão típico de X. campestris pv. viticola. Com o uso de nested-BIO-PCR utilizando dois ciclos de amplificação com os iniciadores RST2/Xcv3R e Xcv1F/Xcv3R foi possível detectar X. campestris pv. viticola em plantas assintomáticas e sintomáticas, coletadas em março de 2007, em Petrolina, PE. xiii Este método mostrou-se mais eficiente que a detecção direta, ou seja, sem uma etapa de enriquecimento em meio de cultura. Além disso, foi possível reduzir para 72 horas o tempo para detecção e identificação de X. campestris pv. viticola, tempo reduzido se comparado aos métodos convencionais. A alta similaridade observada entre as duas patovares, viticola e mangiferaeindicae de X. campestris foi comprovada através da análise de seqüências de nucleotídeos de diferentes regiões genômicas, ITS, 16S rRNA, hrpB6 e o gene do citocromo “b561-like”. Os resultados também sugeriram que as duas patovares estariam mais próximas filogeneticamente a X. campestris e X. axonopodis. Testes de inoculação cruzada em videira e mangueira mostraram a capacidade de X. campestris pv. mangiferaeindicae de infectar plantas de videira e confirmaram a patogenicidade de X. campestris pv. viticola à mangueira, quando a inoculação é feita por infiltração foliar. O estudo dos perfis plasmideais mostrou variabilidade entre as estirpes em relação ao número e tamanho dos plasmídeos, sendo o primeiro relato da presença de plasmídeos em X. campestris pv. viticola. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The bacterium Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, causal agent of grapevine bacterial canker, was first detected in Brazil in the irrigated areas of the São Francisco river basin, in Petrolina, State of Pernambuco, in 1998. The disease was also reported in Juazeiro, Bahia and later in the states of Piauí, Ceará, Roraima and Goiás. The use of pathogen-free propagative material has become an important concern, considering the restricted occurrence of this pathogen in the country and the risk of dissemination to other grapevine production regions in the south and southeast of the country. In order to develop a molecular method for detection and identification of this pathogen, three primers were designed based on the partial sequences of the hrpB gene. The primers combinations Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R were tested for specificity and sensitivity in detecting X. campestris pv. viticola DNA. With the two sets of primers, amplification was positive with all 44 X. campestris pv. viticola isolates tested, 4 isolates of pathovar mangiferaeindicae and 5 of X. axonopodis pv. passiflorae. Digestion of PCR products with HaeIII allowed differentiation of these 3 pathovars. None of the primer pairs were able to amplify grapevine DNA, DNA from 20 non pathogenic bacterium from the grapevine microflora, or DNA from 9 isolates from 7 genera of plant pathogenic bacteria. Sensitivity of the primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified X. campestris pv. viticola DNA, respectively. The detection limit for RST2/Xcv3R was 104 UFC/ml, but this limit could be lowered to 102 CFU/ml with a second round of amplification using the internal primer Xcv1F. The primers were tested for detecting of X. campestris pv. viticola in grapevine petioles previously inoculated with strain UnB 1186, and although amplification was not possible using extracts of macerated plant tissue, detection was possible using agar plate washes after 72 h of growth, or from a single colony diluted in 200 􀈝l of water. Using Nested-BIO-PCR with two amplification rounds with RST2/Xcv3R and Xcv1F/Xcv3R primers, it was possible to detect X. campestris pv. viticola in both symptomatic and asymptomatic plants. This method was more effective than a method that employed direct detection from boiled macerated extracts with no previous enrichment on culture medium. The use of BIO-PCR reduced the time needed for detecting and identifying X. campestris pv. viticola to 72 hours, when compared to more traditional diagnostic methods. xv The high similarity observed between the two pathovars of X. campestris, viticola and mangiferaeindicae was cnfirmed by the analysis of nucleotide sequences from different genomic regions, ITS, 16S rRNA, hrpB6 and the cytochrome b561-like gene. The results also suggested that these two pathovars are phylogenetically related to X. campestris and X. axonopodis. Cross inoculation tests on grapevine and mango plants inoculation, showed the ability of X. campestris pv. mangiferaeindicae to infect grapevine and confirmed the pathogenicity of X. campestris pv. viticola to mango plants, when using the infiltration technique. Plasmid DNA extractions showed variability among strains of the two pathovars in plasmid number and size. This is the first report of plasmid occurrence in X. campestris pv. viticola.