Efeito da presença da insulina-transferrina-selênio (ITS) e L-ácido ascórbico (AA) na produção in vitro de embriões bovinos

Abstract

Na tentativa de melhorar os índices da produção in vitro de embriões (PIVE) em bovinos, várias substâncias têm sido utilizadas na maturação in vitro (MIV) e no cultivo in vitro (CIV). A suplementação com a combinação de insulina-transferrina-selênio (ITS) e o ácido ascórbico (AA) têm sido associada com a redução na produção de radicais livres nos meios de cultivo celular, sendo uma alternativa para melhorar os resultados da PIVE. O presente estudo visou testar o efeito da presença do ITS e AA durante a MIV e/ou CIV na quantidade e qualidade de embriões PIVE. Complexos cumulus-ovócitos (COCs) foram obtidos de ovários de abatedouro, sendo que os provenientes de folículos de 1-3mm e 6-8mm foram dissecados da córtex ovariana e os de 3-8mm obtidos por aspiração folicular. Para avaliar os estágios da meiose os ovócitos foram corados com lacmóide, e para avaliar o efeito dos tratamentos na produção de embriões foi avaliada a taxa de clivagem (D2), blastocisto (D7), o tamanho dos embriões com auxílio da câmera Motic Images Plus 3.0 e o número total de células pela coloração HOESCH. Os dados de cinética de maturação, desenvolvimento embrionário, e tamanho dos embriões foram analisados pelo teste do Qui-Quadrado (P<0.05), e a contagem do número de células embrionárias pelo teste de Kruskall-Wallis (P<0.05). Inicialmente foi avaliado o efeito do ITS (0,5μg/ml) durante a MIV, durante o CIV e durante a MIV e o CIV. Todos os tratamentos apresentaram taxa de clivagem, produção de blastocisto e qualidade dos blastocistos semelhante ao grupo controle na ausência de ITS (P>0,05). A suplementação do meio com uma associação do ITS e AA por diferentes períodos (12h e 24h) durante a MIV, mostrou que quando realizada nas 12 últimas horas causa um aumento na produção de blastocistos em D7 (51,6%) quando comparado ao grupo controle (39,5%), e aos grupos expostos nas primeiras 12h (40,2%), e nas 24h (41,1%). Apesar do número de células ter sido maior nos embriões do grupo tratado com ITS e AA nas últimas 12h de MIV (143,2±49,9) em relação aos grupos expostos nas primeiras 12h (122,3±46,1), não diferiu (P>0,05) dos grupos controle (131,9±44,7) e do tratado por 24h (124,3±35,3). A cinética de maturação nuclear foi comparada em ovócitos de diferentes competências obtidos de folículos de 1-3 e 6-8mm de diâmetro, e foi observado que as 24h de maturação todos os ovócitos, independente do grupo, tinham completado a meiose sendo que em torno de 90% encontrava-se em estagio de MII. Então, foi investigado o efeito da presença do ITS associado ao AA nas 12 últimas horas da MIV em ovócitos com diferentes graus de competência. O tratamento não afetou (P<0.05) as taxas de clivagem e blastocisto quando ovócitos provenientes de folículos 1-3mm foram utilizados, sendo respectivamente 49,9% e 4,4% e 51,0% e 14,9% para os tratados e não tratados.Conclui-se que a adição de ITS isoladamente não afetou a produção de embriões, mas quando associado ao AA nas 12 últimas horas de maturação melhorou a quantidade e qualidade dos embriões produzidos. Além disso, o uso de ITS e AA durante a MIV não melhorou a competência de ovócitos provenientes de folículos pequenos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

In attempt to improve bovine in vitro embryos production (IVP), several substances have been used during the in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC). Supplementation with a combination of insulin-transferrin-selenium (ITS) and ascorbic acid (AA) have been associated with a reduction in free radicals production in cell culture media, being an alternative to improve the results of IVP. The present study aimed to test the effect of ITS and AA during IVM and / or IVC in the quantity and quality of IVP embryos. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from slaughterhouse ovaries. Which were either recovered from Follicles of 1-3mm and 6-8mm dissected from the ovarian cortex, or from aspiration of 3-8mm follicles. . To evaluate the stages of meiosis oocytes were stained with lacmóide, and to assess the effect of treatments on embryo production cleavage rate (D2), blastocyst rate (D7), size of the embryos using the camera Motic Images Plus 3.0 and the total number of cells staining by HOESCH, were evaluated. Data of maturational kinetics, embryonic development, and size of the embryos were analyzed by chi-square test (P<0.05), and embryonic cells number by Kruskal-Wallis test (P<0.05). Initially we investigated the effect of ITS (0.5 mg/ml) during IVM, IVM and IVC and during IVC. All treatments had similar cleavage rate, blastocyst production and embryo quality to the control group (P<0.05). Medium supplementation with a combination of AA and ITS for different periods (12h and 24h) during IVM, showed that when treatment was performed in last 12 h an increase in production D7 blastocysts (51.6%) was observed whem compared the control (39.5%), first 12h (40.2%) and 24h groups (41.1%). Although the number of cells was higher in the group treated with ITS and AA in the last 12h of IVM (143.2 ± 49.9) than in groups exposed in the first 12h (122.3 ± 46.1), it did not differ (P> 0.05) from the control (131.9 ± 44.7) and treated for 24h group (124.3 ± 35.3). The kinetics of nuclear maturation was compared between oocytes of different competence obtained from follicles of 1-3 and 6-8mm diameter, it was observed that the at 24h of maturation every oocyte, around 90% of the oocytes were in MII stage. Then, we investigated the effect of ITS associated with AA in the last 12 hours of IVM in oocytes with different degrees of competence. Treatment did not affect (P<0.05), the cleavage and blastocyst rate when oocytes from follicles 1-3mm were used, being respectively 49.9% and 4.4% and 51.0% and 14.9% for those treated and untreated. It was concluded that the addition of ITS alone did not affect the production of embryos, but when combined with AA in the last 12 hours of maturation improved quantity and quality of embryos produced. Furthermore, the use of AA and ITS during IVM not improve the competence of oocytes from small follicles.