Organogênese, embriogênese somática e uso de óleo mineral como estratégias de propagação e conservação in vitro de Piper aduncum L. e Piper hispidinervum C. DC

Abstract

Este trabalho teve como objetivo desenvolver a organogênese e embriogênese somática e avaliar o uso do óleo mineral na propagação e conservação in vitro de Piper aduncum e Piper hispidinervum, bem como avaliar a estabilidade genômica dos acessos regenerados. Plantas germinadas in vitro foram utilizadas como material vegetal. Inicialmente, as sementes passaram por processo de desinfestação, antes da inoculação em meio de crescimento. Para os testes de germinação foram utilizados os meios de cultura de MS e WPM, com incubação nas temperaturas de 25 ºC e 30 ºC, nas condições de luz e escuro. Foi avaliada a taxa de germinação (%), o tempo médio de germinação e a velocidade de germinação. Os resultados sobre a germinação das sementes cultivadas em meio de cultura de MS e WPM a 25 ºC foram: taxa de Germinação = 84% e 81% (P. aduncum MS/WPM), 100% e 100% (P. hispidinervum MS/WPM); tempos médios de germinação = 253,429 e 240,593 horas (P. aduncum MS/WPM), 202,320 e 190,320 horas (P. hispidinervum MS/WPM); velocidades médias de germinação = 3,94 h-1 e 4,14 h-1 (P. aduncum MS/WPM); 4,94 h-1 e 5,25 h-1 (P. hispidinervum MS/WPM). As médias de germinação ficaram com valores próximos em ambos os meios de cultura testados. A germinação das sementes cultivadas em meio WPM a 25 ºC e 30 ºC foram: taxa de Germinação = 81% e 74% (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC), 100% e 96% (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC), tempo médio de germinação = 240,593 e 333,081 horas (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 190,320 e 215,250 horas (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC), velocidades médias de germinação = 4,14 h-1 e 3,00 h-1 (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 5,25 h-1 e 4,64 h1 (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC). A temperatura de 25 ºC proporcionou maior percentagem de germinação dentro do menor espaço de tempo para ambas as espécies. Nos testes de micropropagação foi avaliado o cultivo de microestacas em meios de cultura com diferentes concentrações de sais de MS e WPM (50, 70 e 100%), e em outra etapa, o cultivo em meio de MS adicionado de diferentes concentrações dos reguladores BAP (6-benzilaminopurina) e KIN (Cinetina) (0,00; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L-1). Na primeira etapa os dados apresentaram diferenças significativas no que diz respeito ao número de formação de gemas e à altura em ambas as espécies. P. aduncum apresentou melhores resultados, tanto no número de gemas quanto na altura, quando cultivada em meio com concentrações de 50% e 75% de sais de MS e em 75% e 100% de sais de WPM, enquanto P. hispidinervum apresentou melhor desempenho quando cultivada em meio de WPM nas concentrações de 75% e 100%. Com relação ao meio de cultura adicionado dos reguladores de crescimento, P. aduncum apresentou melhores resultados nos tratamentos com 0,50 mg.L-1 de KIN e 0,05 mg.L-1 de BAP, com maior número de brotos; para P. hispidinervum as concentrações dos reguladores foram significativas apenas quando se utilizou o BAP, com melhores resultados obtidos na concentração de 1,0 mg.L-1. Para se determinar um protocolo visando a embriogênese somática a partir de explantes foliares de P. hispidinervum e P. aduncum foram realizados testes combinando diferentes concentrações de ANA (ácido α-naftalenoacético) e BAP adicionados ao meio de MS, formando 5 tratamentos: T1 (5 mg.L-1 de ANA + 0 mg.L-1 de BAP), T2 (10 mg.L-1 de ANA + 0 mg.L-1 de BAP,) T3 (0 mg.L-1 de ANA + 2,5 mg.L-1 de BAP), T4 (5 mg.L-1 de ANA + 2,5 mg.L-1 de BAP) e T5 (10 mg.L-1 de ANA + 2,5mg.L-1 de BAP). Aos 60 dias de cultivo, no escuro, o tratamento T4 proporcionou os melhores resultados para a indução de calos primários em P. aduncum com 80% de formação de calos. A transferência dos calos primários para o meio T5 (10 mg.L-1 de ANA + 2,5mg.L-1 de BAP) ocasionou a formação de calos embriogênicos e surgimento de embriões somáticos. De maneira geral, a regeneração dos embriões somáticos teve início 15 dias após a transferência para meio de crescimento de MS, sob condições de luz. As plantas regeneradas a partir dos embriões de P. aduncum apresentaram crescimento mais lento, portanto, apenas as plantas regeneradas a partir dos embriões de P. hispidinervum foram pré-aclimatizadas e levadas para casa de vegetação. A citometria de fluxo foi utilizada verificar a estabilidade genômica das plantas de P. hispidinervum regeneradas, no que diz respeito à quantidade de DNA. Os resultados revelaram que o conteúdo médio estimado de DNA de P. hispidinervum provenientes de plantas da embriogênese somática e da casa de vegetação foi de 1,8329 ± 0,02 pg e 1,8666 ± 0,05 pg, respectivamente, não havendo existência de instabilidade genômica nas plantas avaliadas. Para a conservação de germoplasma in vitro foi testada a estratégia de conservação por de imersão em óleo mineral (OM). Microestacas de P. aduncum e P. hispidinervum foram inoculadas em tubos de ensaio e cobertas completamente com óleo mineral, sendo cultivadas durante 30 e 180 dias. Aos 30 dias de cultivo, as estacas de P. aduncum e P. hispidinervum submersas em óleo mineral (OM) apresentaram taxa de 100% e 80% de sobrevivência, respectivamente. As estacas vivas foram transferidas para meio de crescimento e após 120 dias de cultivo apenas as estacas de P. aduncum apresentaram sobrevivência (30 %). Na etapa de 180 dias de cultivo, apenas as estacas de P. aduncum sobreviveram, obtendo taxa sobrevivência 40%. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

This study aimed to develop the organogenesis, somatic embryogenesis and mineral oil as in vitro propagation and conservation strategies of Piper aduncum and Piper hispidinervum as well as assess the genomic stability of regenerated plants. Germinated seeds passed through the process of disinfecting before inoculation into the growth medium. In order for germination tests were used MS and WPM growing medium, with incubation at 25 º C and 30 º C, under the conditions of light and dark. It was evaluated the rate of germination (%), the germination mean time and the speed of germination. The measures of seed germination grown on MS and WPM medium at 25 °C were: rate of germination= 84% and 81% (P. aduncum MS/WPM), 100% and 100% (P. hispidinervum MS/WPM); germination mean time= 253,429 and 240,593 hours (P. aduncum MS/WPM), 202,320 and 190,320 hours (P. hispidinervum MS/WPM); speed of germination= 3,94 h-1 and 4,14 h-1 (P. aduncum MS/WPM); 4,94 h-1 and 5,25 h-1 (P. hispidinervum MS/WPM). The measures germination have demonstrated similar values in both growing medium. The measures of seed germination grown on WPM medium at 25 °C and 30 ºC were: rate of germination= 81% and 74% (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC), 100% and 96% (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC); germination mean time= 240,593 and 333,081 hours (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 190,320 and 215,250 hours (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC); speed of germination= 4,14 h-1 and 3,00 h-1 (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 5,25 h-1 and 4,64 h-1 (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC). The temperature 25 °C had proportioned higher percentage of germination into the shortest time in both species. In the micropropagation tests were evaluated microshoots growing in MS and WPM medium with different concentrations of salts (50, 70 and 100%), and in another step, the culture in MS medium supplemented with different concentrations of BAP (6-benzylaminopurine) and kinetin regulators. (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mgL-1). In the first step the results showed significant differences regarding the number of bud formation and height in both species. P. aduncum achieved better results, as numbers of buds as height when grown in medium with 50%, 75%, 100% MS and 50%, 75% and 100% WPM salts concentrations, on the other hand, P. hispidinervum showed the best performance when cultivated in 75% and 100% WPM medium concentrations. Regarding to the culture medium supplemented with regulators, P. aduncum achieved better results in the treatments with 0.50 mgL-1 kinetin and 0.05 mgL-1 BAP which resulted in larger number of shoots, for P. hispidinervum concentrations of regulators were significant only with the use of BAP, and the best results obtained in the concentration of 1.0 mg.L-1. In order to determine a protocol aiming the formation of callus from leaf explants of P. hispidinervum and P. aduncum tests were conducted by combining different concentrations of NAA (α-naphthaleneacetic acid) and BAP added to MS medium, forming 5 treatments: T1 (5 mg.L-1 NAA + 0 mg.L-1 BAP), T2 (10 mgL-1 NAA + 0 mg.L-1 BAP) T3 (0 mg.L-1 + NAA 2.5 mg.L-1 BAP), T4 (5 mg.L-1 + NAA 2.5 mg.L-1 BAP) and T5 (10 mg.L-1 NAA + 2.5 mg.L-1 BAP). Treatment T4 showed the best result in the primary callus induction after 60 days of culture in the dark (P. aduncum with 80% and P. hispidinervum 32% of primary callus formation). The transfer of calluses primary for the treatment T5 (10 mg.L-1 de NAA + 2.5 mg.L-1 de BAP) resulted in the formation of embryogenic callus and somatic embryo emergence. The regeneration of the embryos began 15 days after transfer to growth medium with salts and nutrients of MS and cultivation under light conditions. Plants regenerated from the embryos of P. aduncum grew slower, so only the plants regenerated from the embryos of P. hispidinervum were pre-acclimatized and taken to a greenhouse. The flow cytometry was used to verify the stability of the genome of P. hispidinervum plants regenerated with regard to the amount of DNA. The results showed that the estimated DNA contents of P. hispidinervum from somatic embryogenesis and greenhouse (1.8329 ± 1.8666 ± 0.02 pg and 0.05 pg) with a coefficient of variation below 5% leads to the conclusion about the absence of genomic instability in plants obtained by somatic embryogenesis. For Germplasm in vitro conservation was tested conservation strategy by immersion in mineral oil (MO). Microshoots from P. aduncum and P. hispidinervum were inoculated into sampling tubes and completely covered with mineral oil and cultured for 30 and 180 days. After 30 days of culture, the stakes of P. aduncum and P. hispidinervum submerged in mineral oil (MO) had a survival rate of 100% and 80% respectively. The live cuttings were transferred to growth medium and after 120 days of cultivation only cuttings of P. aduncum showed a survival rate (30%). In the stage 180 days of cultivation, cuttings P. aduncum and P. hispidinervum submerged in mineral oil (MO) had survival rates of 40% and 0% respectively.