Fototoxicidade de nanoemulsão de extrato de crajiru (Arrabidaea chica) em linhagem de células de adenocarcinoma mamário murino (4T1)

Abstract

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia alternativa a cura de diversas doenças, entre elas o câncer. Um novo conjunto de fármacos fotossensibilizantes (FS) de origem natural oriunda de extratos e óleos vegetais tem sido testado na terapia contra o câncer. Porém, a maioria desses fármacos FS apresentam alguns entraves para uso clínico e nesse contexto, as nanoemulsões poliméricas, sistemas cineticamente estáveis, apresentam diversas potencialidades como sistemas carreadores de fármacos. O objetivo do presente estudo foi identificar e avaliar as possíveis propriedades fotoquímicas e fotofísicas do extrato clorofórmico de partes aéreas de crajiru (Arrabidaea chica) livre (ECr) e incorporado em nanoemulsão polimérica (NanoECr) e testar os efeitos da nanoemulsão na TFD contra células de adenocarcinoma mamário murino (4T1) in vitro. Por análises no espectrofotômetro, tanto o ECr quanto a NanoECr apresentaram absorbância em comprimento de onda de 670 nm e fluorescência em 690 nm e apresentaram produção de espécies reativas de oxigênio pelo teste de decaimento da absorbância do benzofurano, características fundamentais para serem considerados fármacos úteis em TFD. Pela técnica de espalhamento dinâmico da luz, a NanoECr apresentou diâmetro hidrodinâmico médio de 370,5 ± 264,31 nm, PdI de 0,133 ± 0,01 e carga de superfície de – 36,1 ± 0,15 mV, características que predizem que a formulação é estável. Nas microscopias eletrônicas de transmissão (MET) e varredura (MEV), as NanoECr apresentaram morfologia esférica e superfície rugosa com diâmetros médios de 374 ± 117 nm (MET) e 367 ± 69 nm (MEV antes da metalização) e 488 ± 70 nm (após metalização), sendo a MEV sem metalização o protocolo adequado para caracterização morfométrica dessas nanoestruturas. Após incubação da linhagem celular 4T1 com a NanoECr em várias concentrações na ausência de irradiação, foi determinada, por MTT, a concentração não tóxica (54 µg/mL) e em seguida, por espectrofotômetro e microscopia confocal o tempo máximo de interação da NanoECr com a linhagem 4T1 (15 minutos). Associando 54 µg/mL de NanoECr, por 15 min com irradiação com laser de comprimento de onda de 670 nm, morte celular ocorreu quando as células foram 2 2irradiadas com doses de energia variando entre 8,57 J/cm a 85,7 J/cm, e apenas na 2dose de energia de 85,7 J/cm (maior dose de energia utilizada no experimento) ocorreu 100% de morte celular. Na avaliação do tipo de morte celular, as células 2irradiadas em doses de energia de 25,7 J/cm apresentaram morte por apoptose, visualizada em microscopia confocal pela intensa marcação em laranja de corpos apoptóticos (laranja de acridina) e pela visualização de blebs e danos a mitocôndrias e 2retículo endoplasmático observados em MET. Já na dose de 85,7 J/cm, a necrose foi o tipo de celular ocorrido, observado pela intensa marcação do citoplasma das células em vermelho (brometo de etídeo) em microscopia confocal e por danos a membrana plasmática com extravasamento de conteúdo celular e presença de vacúolos no interior das células observadas em MET. Concluiu-se que o extrato clorofórmico de partes aéreas do crajiru incorporado em nanoemulsões poliméricas de PVM/MA é uma potencial formulação fotossensibilizante para uso em TFD. Além disso, as características desta preparação oferecem a perspectiva de que esta possa ser utilizada como um fotossensibilizante de 3ª geração na TFD. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative therapy to cure a lot of diseases, including cancer. A new set of photosensitizing (PS) drugs arising from natural plants, as vegetable oils and extracts have been tested in cancer therapy. However, most of these PS drugs present some difficulties for clinical use and in this context, polymeric nanoemulsions, kinetically stable systems, have several potential as drug carrier systems. The aim of this study was to identify and evaluate possible photochemical and photophysical properties of the chloroform extract of aerial parts of crajiru (Arrabidaea chica) free (ECR ) and incorporated in polymeric nanoemulsion (NanoECr) and test the effects of this nanoemulsion in PDT against murine mammary adenocarcinoma cells ( 4T1 ) in vitro. By spectrophotometer analysis in both the ECr and NanoECr showed absorbance at a wavelength of 670 nm and fluorescence at 690 nm and production of reactive oxygen species by the decay of the absorbance of the test benzofuran, key features to be considered useful drugs in PDT. At the technique of dynamic light scattering, the NanoECr had an average hydrodynamic diameter of 370.5 ± 264.31 nm , PdI of 0.133 ± 0.01 and surface charge of - 36.1 ± 0.15 mV , characteristics that predict the formulation is stable. At transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM), the NanoECr showed spherical morphology and a rough surface with an average diameter of 374 ± 117 nm (TEM), 367 ± 69 nm (SEM before etallization) and 488 ± 70 nm (SEM after metallization). The SEM without metallization was the most suitable protocol for morphometric characterization of these nanostructures. After incubation of 4T1 cell line with various NanoECr concentrations in the absence of irradiation, non-toxic concentration (54 µg/mL) was determined by MTT and then by confocal microscopy and spectrophotometer the maximum time of interaction between NanoECr and 4T1 line (15 minutes) was also determined. Associating 54 µg/mL of NanoECr for 15 min and irradiating the cells with a laser of 670 nm wavelength, cell death occurred when 2 2the cells were irradiated with energy ranging from 8.57 J/cm to 85.7 J/cm and only on 2the energy dose of 85.7 J/cm (higher dose of energy used in the experiment) occurred 100 % of cell death. Evaluating the type of cell death, cells irradiated at a energy dose 2of 25.7 J/cm had death by apoptosis, visualized by intense cytoplasmic stainning of the apoptotic bodies with acridine orange in confocal microscopy and a visualization of blebs and mitochondria and endoplasmic reticulum damage observed in TEM. At a 2,energy dose of 85.7 J/cm necrosis was the type of cellular occurred noted by intense staining of cells cytoplasm in red (ethidium bromide) in confocal microscopy and cell membrane damage with leakage of cellular contents and presence of vacuoles inside the cells observed in TEM. We can conclude that the chloroform extract of the aerial parts of crajiru incorporated in polymeric nanoemulsions is a potential photosensitizer formulation for use in PDT. Furthermore, the characteristics of this formulation offer the prospect that it can be used as a 3rd generation photosensitizer in PDT.