Estabelecimento de um sistema de genética reversa para Pepper mild mottle virus e uso da capa proteica como apresentador de epítopos

Abstract

Pepper mild mottle virus (PMMoV) é um tobamovírus que possui genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva. O vírion é composto pelo genoma envolvido por múltiplas cópias da proteína do capsídeo (CP). A fim de construir clones infectivos de PMMoV para desenvolver vetor de expressão de proteína heteróloga, duas estratégias simplificadas foram avaliadas, a primeira baseada na produção in vitro de transcritos infectivos e a segunda com o uso de vetor binário para agroinoculação. Primeiramente, o cDNA de PMMoV foi clonado no vetor pCR4-TOPO e, posteriormente, subclonado em pUC19, sob o comando do promotor T7 para a realização da transcrição in vitro. Os transcritos foram inoculados em folhas de Nicotiana benthamiana e após três semanas mostraram sintomas de mosaico e distorção foliar, indicações diretas da recuperação do vírus com este procedimento. A recuperação de vírus e infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV e microscopia eletrônica de transmissão. A segunda estratégia consistiu na clonagem do genoma no vetor binário derivado de pTRV2-MCS contendo o plasmídeo pCAMBIA 0390 modificado, pela técnica de overlap-extension PCR. A clonagem foi confirmada a partir da análise do padrão de digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Agrobacterium tumefaciens foi transformada com a construção pCAMBIAPMMoV e folhas de N. benthamiana foram inoculadas para avaliar a recuperação do vírus. As plantas agroinoculadas apresentaram sintomas típicos de PMMoV em folhas inoculadas e folhas acima. A infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV. A possibilidade da adição de epítopos na capa proteica do vírus como ferramenta biotecnológica foi avaliada, inserindo genes de epítopo do vírus da dengue no clone agroinfectivo. Essa estratégia poderá fornecer uma ferramenta de apresentação de epítopos na superfície da CP em partículas montadas de PMMoV em grande escala. Um peptídeo de 24 aminoácidos contendo dois epítopos em tandem localizado nos domínios I/II da proteína E de DENV-1 foi inserido em duas posições distintas no gene cp: um entre os aminoácidos 59/60 e outro entre os aminoácidos 154/155. Após a inoculação, não apareceram sintomas de PMMoV e não foi possível detectar CP modificada em ambas as construções, apesar da confirmação dos clones por sequenciamento. Provavelmente a adição de 24 aminoácidos em cp interferiu no padrão de dobramento e na sua propriedade de automontagem. O tamanho do epítopo para display deverá ser avaliado no futuro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a tobamovirus and consists of a monopartite single-stranded RNA genome in a positive polarity. The virion forms nucleoproteins in rodshaped rigid particles. Aiming to construct infectious PMMoV clones for expressing heterologous proteins, two distinct, strategies were attempted. The first strategy was based on in vitro infectious transcripts and the second on binary vector for agro-infiltration. The cDNA of PMMoV was cloned into pCR4-TOPO and subcloned into pUC19 under the T7 promoter for in vitro transcription. Transcripts were inoculated in Nicotiana benthamiana leaves. After three weeks plants showed typical PMMoV symptoms, such as mosaic and distortion. The virus recovery, hence infection, was confirmed by DIBA using polyclonal antibody raised against PMMoV and electron microscopy. The PMMoV complete genome and the binary plasmid, derived from pTRV2-MCS (modified pCAMBIA 0390) were fused by overlapextension PCR. Selected clones were confirmed by restriction digestion profile and DNA sequencing. N. benthamiana plants were agroinoculated with A. tumefaciens harvesting pCAMBIA-PMMoV clones. Plants showed symptoms similar to those from wild type virus both in inoculated and upper leaves. Infection was confirmed by DIBA. The use of coat protein as epitope display platform tool was evaluated by inserting an epitope from Dengue virus 1 in the agroinfectious clone pCAMBIA-PMMoV. This strategy can be applied for epitope display on the CP surface in PMMoV particles in large scale. A peptide of 25 amino acids containing two epitopes in tandem (domains I/II E protein from DENV-1) was inserted in two different positions in the cp gene; between amino acids 59/60 and 154/155. After agroinoculation it was not possible to detect CP carrying the epitope in both constructions, however DNA sequencing confirmed the epitope presence. Probably the 25-amino acid insertion in the cp gene led to incorrect CP folding and to unfavorable self-assembly. The epitope length will be evaluated for future display studies.