Produção e caracterização de anticorpos monoclonais específicos para o norovírus gii.4

Abstract

Os Norovírus (NoV) são a principal causa de gastroenterites aguda não bacteriana no mundo. O genoma dos NoV consiste de um RNA fita simples o qual codifica uma poliproteína (clivada em seis proteínas não estruturais) e duas proteínas estruturais. A estrutura da proteína do capsídeo (VP1) é dividida dentro de dois principais domínios: O shell (S) e o protruding (P). Devido à incapacidade de cultivar estes vírus, o estudo morfológico e estrutural tem sido restrito a habilidade da VP1 de se montar em partículas semelhantes a vírus (VLP) as quais são morfológicas e antigenicamente indistinguíveis dos vírions nativo. O desenvolvimento do método de diagnóstico eficaz deste vírus, mesmo ocorrendo mutação rápida, tem desafiado a produção de anticorpos monoclonais (MAb) que reagem com epítopos de vários genótipos de NoV. Aqui foi relatado a produção de MAb contra a VLP de NoV GII.4 e a sua caracterização à partir dos domínios S, P1 e P2 expressos em sistema procariótico. Nesta abordagem, os MAb foram selecionados basea-se em sua reatividade obtida no ELISA utilizando VLP e MAb selecionados foram testados por Western blotting contra os domínios S, P1 e P2 expresso em E.coli. Nossos resultados demonstraram que todos os MAb selecionados nesse estudo reconheceram o domínio S, embora a densidade óptica obtida no ELISA indireto demonstraram baixa afinidade. Este resultado sugeriu que uma possível desnaturação ou degradação da VLP foi responsável pela fraca ligação observada no ELISA. Em conclusão, nossos resultados mostram uma possibilidade de que a preservação da VLP intacta consiste em etapa essencial para a seleção de MAb que possuem boa sensibilidade para posteriormente serem utilizado no diagnóstico de NoV por ELISA. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Norovirus (NoV) is the main cause of acute non-bacterial gastroenteritis worldwide. NoV genome consists of a single-stranded RNA which encodes one polyprotein (which is cleaved into six non-structural proteins) and two structural proteins. The capsid protein (VP1) structure is divided into two major domains: The Shell (S) and Protruding (P) domains. Due to the inability to propagate the virus in cell cultures, the structural and morphological study have been restricted using self-assembled virus-like particles (VLP) by expressing VP1 which are morphological and antigenically indistinguishable from native virions. The development of effective method of diagnosis of this virus, even occurring rapidly changing, has challenged aiming to produce monoclonal antibodies (MAb) that react to several different genotypes of NoV. Here, we report the production of MAb raised against the VLP of a NoV GII.4, and the selected MAb were characterized by Western blotting against S, P1 and P2 domains prepared through the prokaryotic expression system. Our results demonstrated that all MAb selected in this study recognized the S domain, however the optical density values achieved by the indirect ELISA demonstrated low affinity of MAb to the prepared VLP. This result suggests that possible denatured or degraded VLP were responsible for low reactivity in the ELISA. In conclusion, our results show a possibility that the preservation of intact VLP is an essential step to select MAb and posterior detection of NoV by ELISA for good sensibility.