Construção de clone infeccioso e caracterização molecular de novos isolados de Pepper ringspot virus

Abstract

Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus, até o momento, detectado somente no Brasil, que destaca-se dentro do gênero por apresentar curiosa associação entre as partículas virais e mitocôndrias do hospedeiro. Os poucos avanços descritos desde a década de 60 aos dias atuais não foram suficientes para demonstrar o mecanismo físico-químico que explica essa relação. Na tentativa de ampliar o campo de estudo em PepRSV, buscou-se contruir um cDNA infeccioso visando o desenvolvimento de uma ferramenta capaz de expressar proteínas heterólogas ou induzir o silenciamento gênico: “virus induced gene silencing” (VIGS). Essa tecnologia visa a mesma aplicabilidade do cDNA infeccioso de Tobacco rattle virus (TRV), que já apresentou resultados significativos na indução de VIGS, contudo não pode ser utilizado livremente no Brasil, pois esse vírus é conhecido como praga quarentenária no País. Por essa razão, o uso de TRV em território brasileiro é restrito, principalmente pela dificuldade na obtenção de uma autorização de uso. O PepRSV apresenta genoma bipartido de RNA fita simples. Durante a obtenção do clone desse vírus a ser utilizado como ferramenta molecular, os dois segmentos completos do RNA genômico foram clonados em vetores plasmidiais comerciais (pGEM-T Easy; pCR4) e modificados, em seguida, com a adição do promotor 35S de Cauliflower mosaic virus (CaMV) na extremidade 5' e uma sequência de ribozima na região 3' do genoma de cada segmento. Além da construção dessa ferramenta, propõe-se avaliar a variabilidade do RNA2 de PepRSV, estudos que, atualmente, está restrito a um único isolado. Dois isolados de PepRSV (Pivo4 e Lavrinha) obtidos em campos de tomateiro no município de Luziânia do Estado de Goiás foram utilizados nesse estudo. O RNA2, segmento genômico destes isolados foi sequenciado. A análise filogenética baseada na comparação de sequências de aminoácidos (aa) da capa proteica dos três isolados (Pivo4, Lavrinha e CAM) de PepRSV não separou Pivo4 e Lavrinha do isolado CAM, pois a inferência do algoritmo correspondente bootstrap foi irrelevante. Os isolados obtidos foram semelhantes ao isolado CAM e apresentaram ORF para capa proteica (CP), mas não apresentaram homólogos das ORFs 2a e 2b presentes em isolados da espécie tipo TRV que pertence ao mesmo gênero. A comparação entre os três isolados sugere a presença de uma inserção a downstream a ORF do CP nos isolados Pivo4 e Lavrinha em relação ao isolado CAM e também uma recombinação na região 3' UTR entre as moléculas de RNA2 e RNA1 dessesisolados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Pepper ringspot virus is a Tobravirus until now detected only in Brazil. It is a peculiar virus due to the occurrence of a curious association between viral particles and their host mitochondria. From the 60's to the present day, no studies have been able to demonstrate the physicochemical mechanism underlying this relationship. In an attempt to broaden the studies on PepRSV, it was planned to construct na infectious cDNA clone to be used as a viral vector for expression of heterologous proteins or a virus induced gene silencing (VIGS) vector. It is proposed the construction of an infectious cDNA of PepRSV with a similar applicability of the Tobacco rattle virus (TRV) vector. It is already shown that this vector is useful in the induction of VIGS. The TRV vector cannot be used in Brazil, because it is a quarantine pest. Hence the use of TRV in Brazil is extremely limited, mainly due to the difficulty of obtaining a permission to use in the Brazilian territory. The virus has a bipartite genome of single strand RNA components. During the construction development, the two complete segments of the genome of PepRSV were cloned in plasmid vectors (pGEM-T Easy; pCR4) and modified to contain a promoter 35 of Cauliflower mosaic virus in the 5' end and a ribozyme sequence in the 3' region of the genome of each segment. Additionally to this construction for infectious clones, we propose to assess the variability of the PepRSV RNA2, which was restricted to a single isolate. Two PepRSV isolates (Pivo4 and Lavrinha) obtained in tomato fields in the county of Luziânia, Goiás State. The genome segment (RNA 2) of these isolates was sequenced. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of coat protein (CP) among three isolates did not separate those isolates in different ramifications due to lower bootstrap value. The isolates obtained were in agreement as CAM isolate for coat protein (CP) ORF feature, but do not showed homologous ORFs2a and 2b present in TRV isolates of the Tobravirus type species. By sequence comparison, Pivo4 and Lavrinha isolates had presentedlarge nucleotides insertion downstream of CP ORF as opposed to CAM isolate suggesting a recombination in 3'UTR between RNA1 and RNA2 of each isolate.