Análise filogenética de espécies americanas de Pinus e construção de um mapa genético de alta densidade para Pinus taeda L. com base em marcadores DArT (Diversity Arrays Technology)

Abstract

Métodos de genotipagem de polimorfismos no DNA em larga escala a baixos custos são fundamentais para ampliar a resolução de estudos filogenéticos e populacionais, viabilizar a integração das tecnologias genômicas na prática do melhoramento genético e auxiliar a montagem de genomas. Neste trabalho, tendo Pinus (Pinus teada L. - Pinaceae) como espécie de interesse, foram desenvolvidos: (1) um estudo filogenético de espécies americanas de Pinus baseado no desenvolvimento de um microarranjo de marcadores moleculares DArT; (2) um mapa genético de alta densidade para P. taeda com base em microssatélites e marcadores genotipados via redução de complexidade genômica e sequenciamento pela metodologia DArT-seq. Para o desenvolvimento da tecnologia DArT, amostras de 16 espécies de Pinus, oito procedências de P. taeda e cinco árvores-elite de P. taeda foram utilizadas para a construção de um microarranjo com 7680 sondas de DNA derivadas de uma fração do genoma com complexidade reduzida via enzimas de restrição. Um total de 4.171 marcadores polimórficos foi identificado entre as espécies de Pinus e 1.211 marcadores entre procedências de P. taeda. Uma análise filogenética de 12 espécies de Pinus da América com 3.273 marcadores DArT, revelou importantes diferenças em relação à proposta mais recente de classificação taxonômica baseada na análise de sequências de DNA cloroplastidial. Nossos resultados sugerem a possibilidade de que P. taeda e demais espécies do norte da América venham a ser classificadas em outra subseção. Um mapa genético com base na análise de 288 megagametófitos haploides da árvore 7-56 de P. taeda foi construído com microssatélites e marcadores DArT-seq (sequências de 69 bases) desenvolvidos a partir da redução da complexidade genômica via enzimas de restrição (PstI-HhaI), e sequenciamento das representações genômicas reduzidas. De um total de 4.367 marcadores DArT-seq de alta qualidade, 2.469 e 32 microssatélites foram mapeados e ordenados em 12 grupos de ligação (n=12 cromossomos em P. taeda) cobrindo 1.226,47 cM, com média de 203 marcadores por grupo de ligação e densidade de 0,62 cM por marcador. O mapa genético foi em seguida utilizado para ancorar 75 clones de BACs (cromossomos artificiais de bactéria) de Pinus taeda disponíveis no NCBI, demonstrando sua potencial utilidade para fins de montagem do genoma, porém corroborando também a natureza repetitiva do genoma ao ancorar múltiplos BACs em diferentes grupos de ligação. O mapa genético aumentou em cerca de 20 vezes a densidade de marcadores dos mapas existentes para a espécie, fornecendo uma ferramenta adicional para estudos de mapeamento genético e montagem do genoma de P. taeda. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Genome-wide, high-throughput and cost-efficient DNA genotyping methods are key to increase the resolution and speed of phylogenetic and populational studies, allow the integration of genomics into breeding and support the assembly of genomes. In this work having loblolly pine (Pinus taeda L. - Pinaceae) as model species we developed: (1) a phylogenetic study of American Pinus species based on the development of a microarray of DArT markers for species of the genus and (2) a high density genetic map for Pinus taeda using microsatellite markers and sequence based genotyping carried out by the DArT (DArT-seq) method using next-generation sequencing. For DArT microarray probe development, DNA samples of 16 species of Pinus, eight provenances of P. taeda and five elite trees of P. taeda were used to build an array of 7,680 probes derived from a restriction enzyme complexity reduced fraction of the pine genome. A total of 4,171 markers were found polymorphic across samples of Pinus species and 1,211 markers across provenances of P. taeda. A phylogenetic study involving 12 American Pinus species using 3,273 DArT markers revealed important differences from the most recent classification proposed based on chloroplast DNA amplified sequences, additionally suggesting the possibility that P. taeda and its close species from North America could be classified into a new subsection. A genetic map, based on a set of 288 haploid megagametophytes of P. taeda tree 7-56 was built with microsatallites and DArT-seq (69 bases tags) markers developed from complexity reduction with double digest (PstI-HhaI) and sequencing. From a total of 4,367 high quality DArT-seq markers, 2,469 and 32 microsatallites were mapped and ordered into 12 linkage groups (n=12 chromosomes in Pinus taeda), covering 1,226.47 cM with an average of 203 markers per linkage group and marker density of 0.62 cM. This genetic map was subsequently used to anchor 75 BAC clones (bacterial artificial chromosomes) of Pinus taeda available in NCBI, demonstrating its potential utility to aid genome assembly, although also corroborating the repetitive nature of the genome as several BAC clones were anchored in multiple positions in different linkage groups. The genetic map presented in this study increased marker density by approximately 20 times the current density of the existing microsatellite maps providing an additional tool for genetic mapping studies and assembly of the P. taeda genome.