Estratégias bionanotecnológica para produção e liberação controlada de peptídeos antimicrobianos

Abstract

Na última década, a urgência na busca de novos e eficientes medicamentos para o combate das infecções hospitalares emergiu, principalmente, em função do desenvolvimento de mecanismos de resistência em microrganismos patogênicos. Neste âmbito, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) surgem como uma potencial classe de substâncias a serem utilizadas na prevenção e controle de infecções por apresentarem múltiplas atividades que incluem tanto atividade bactericida e fungicida, quanto imunoprotetora. Esses peptídeos podem ser encontrados em diversas fontes na natureza como fungos, plantas, animais vertebrados e invertebrados, sendo que diversos estudos já demonstraram serem raros os episódios de resistência aos PAMs. Entretanto, estas moléculas estão presentes em concentrações muito baixas inviabilizando a sua utilização a partir da purificação de fontes naturais ou síntese química dependendo da esua estrutura primária. Dessa forma, a produção desses peptídeos utilizando ferramentas biotecnológicas permite que os mesmos sejam produzidos e empregados em estudos de estrutura-função e mecanismos de ação. A primeira etapa deste trabalho consistiu na produção heteróloga em sistema procarioto e eucarioto do peptídeo Pg-AMP1 utilizando proteínas de fusão, descrito originalmente com atividade antibacteriana. Entretanto, não foi observada atividade da proteína heteróloga fusionada contra nenhuma das bactérias testadas em ensaios in vitro, visto que o peptídeo não foi clivado. Paralelamente, o peptídeo Cm-p1, originalmente extraído do molusco Cenchritis muricatus, foi sintetizado quimicamente e incorporado a nanofibras para produzir um sistema de liberação controlada. As nanofibras antifúngicas mostraram atividade contra Candida albicans, sendo estas caracterizadas por espectrometria de massas, microscopia eletrônica de varredura, bem como microscopia de força demonstrando que a presença do Cm-p1 pode interferir na morfologia das nanofibras. Além disso, os testes de liberação mostraram que Cm-p1 foi quase todo liberado na primeira hora. A biocompatibilidade das fibras foi avaliada por MTS e geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por células HUVEC, mostrando que as nanofibras contendo o peptídeo não afetaram a viabilidade celular. Somente as fibras contendo 10 % do Cm-p1 aumentaram a geração de ROS e a secreção de citocinas como IL6 e TNF-?. O emprego de ferramentas bionanotecnológicas possibilita a produção e incorporação de peptídeos antimicrobianos em sistemas de liberação controlada de fármacos que podem ser utilizados no tratamento e controle de infecções nosocomiais. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

In the last decade, the urgency in finding new and effective drugs to avoid hospital infections emerged due to the development of mechanisms of resistance in pathogenic microorganisms. In this context, antimicrobial peptides (AMPs) appear as a potential class of substances to be used in the prevention and control of infections by presenting multiple activities that include both bactericidal and fungicidal activities, as well as immunoprotective. These peptides can be found in nature from various sources such as fungi, plants, vertebrates and invertebrates, and several studies have already demonstrated they are rare episodes of AMPs resistance. However, these molecules are synthesized in very low concentrations precluding their use from natural sources or chemical synthesis. Thus, the production of these peptides using biotechnological tools allows their producing and using in studies of structure-function and mechanisms of action. The first step of this work consisted of heterologous production in eukaryote and prokaryote systems of Pg-AMP1 using fusion proteins. Originally, this peptide was described with antibacterial activity. However, unfortunately the fused heterologous protein was not active against any of the bacteria tested in vitro. In parallel, the Cm-p1 peptide, originally extracted from shellfish Cenchritis muricatus, was chemically synthesized and incorporated into nanofibers to produce a controlled release system. Nanofibers showed antifungal activity against Candida albicans, which were characterized by mass spectrometry, scanning electron microscopy, as well as atomic force microscopy demonstrating that the presence of Cm-p1 can interfere with nanofibers morphology. Furthermore, the release tests showed that Cm-p1 was almost completely released within the first hour. The MTS fibers biocompatibility and reactive oxygen species (ROS) generation by HUVEC cells were evaluated, showing that nanofibers containing peptide did not affect cell viability. Only 10% of the fibers containing Cm-p1 increased ROS generation and secretion of cytokines such as IL6 and TNF. The use of bionanotechnology enables the production and incorporation of antimicrobial peptides into controlled release systems that may be used in the treatment of nosocomial infections.