Expressão do Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) e Bone Morphogenetic Protein 15(BMP15) in vitro e seu efeito no processo de luteinização em células da granulosa bovinas

Abstract

Os sistemas de cultivo de células da granulosa vêm se desenvolvendo com o intuito de assemelhar-se às condições esteroidogênicas encontradas in vivo no folículo ovariano. A remoção do ovócito resulta na luteinização espontânea das células somáticas foliculares, com alteração no padrão esteroidogênico, que também acontece quando estas células são colocadas em cultivo. Os fatores secretados pelo ovócito GDF9 e BMP15 possuem uma atuação importante, entretanto, ainda não totalmente esclarecida durante o processo de luteinização das células da granulosa. Com este trabalho objetivou-se expressar os genes GDF9 e BMP15 em cultivo de células da granulosa bovinas transgênicas e avaliar seus efeitos no processo de luteinização. Para a análise da luteinização, foram utilizados cultivo de células da granulosa transfectadas por lipossomos com vetores portando os genes GDF9 e BMP15, com coleta de meio e células obtidas diariamente durante 21 dias para dosagens de hormônios esteróides e análise da expressão gênica. Como marcador do processo de luteinização foi utilizado o gene StAR. A partir do mRNA das células foi possível verificar a expressão do GDF9, BMP15 e de seus respectivos receptores (ALK5, ALK6 e BMPRII). A análise da atividade esteroidogênica das células transgênicas demonstrou que a presença de GDF9 e BMP15 exerce inibição na produção do hormônio progesterona. O gene StAR, principal fator limitante da esteroidogênese, foi inibido após o pico de produção de progesterona, o que indicou uma provável atuação do GDF9 e BMP15 por meio desta via. Esse estudo aborda novas informações, que contribuem para o entendimento dos mecanismos moleculares e parácrinos pelos quais o ovócito é capaz de inibir a luteinização das células da granulosa, antes do início dos processos de maturação ovocitária e ovulação iniciados pelo pico de LH. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Granulosa cell culture is carried out to establish a similar steroidogenesis environment found in ovarian follicles. Somatic follicular cells spontaneously luteinize and modify their steroidogenesis activity when the oocyte is removed in the same away it happens in vivo. The GDF9 and BMP15 are oocyte secreted factors that have an important role on the luteinization of granulosa cells, but their effects are not totally understood. With the culture of transgenic bovine granulosa cells this work aimed to express the genes GDF9 and BMP15 and evaluate their effects on the luteinization process. Samples of cells and culture medium were obtained during 21 consecutive days to analyze the steroidogenic hormones concentration and gene expression. To confirm the expression of GDF9, BMP15 and their respective receptors (ALK5, ALK6 e BMPRII) the cDNA were amplified by PCR. The analysis of steroidogenic activity of transgenic cells demonstrated that the presence of GDF9 e BMP15 inhibits the production of progesterone and StAR gene expression. The StAR gene is the most limiting factor of steroidogenesis, and was used as a molecular marker of the luteinization process. This indicates that the inhibitory effect of GDF9 and BMP15 on the stereidogenesis use the StAR pathway. This study shed light in the molecular and paracrine mechanisms, by which the oocyte can inhibit the luteinization of granulosa cells before the induction of maturation and ovulation by the LH peak.