Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Paracoccidioides brasiliensis : caracterização do gene/cDNA e análise funcional da proteína recombinante

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 36 kDa e pI 6.8 e mostraram homologia com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) de diversos organismos. O cDNA completo e o gene que codificam para PbGAPDH foram obtidos e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 338 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbGAPDH nativa. O gene Pbgapdh contém 5 exons interrompidos por 4 introns. Análises realizadas com a PbGAPDH deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também evidenciaram a correlação entre a filogenia e as posições dos introns nos genes cognatos. A expressão de Pbgapdh foi analisada e uma única espécie de mRNA de 2.0 Kb, preferencialmente expressa na fase leveduriforme de P. brasiliensis foi detectada em concordância com os altos níveis de expressão da proteína. A proteína recombinante GAPDH foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia imunoeletrônica e análises por Western blot, foi detectada a presença da GAPDH, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A GAPDH recombinante foi capaz de se ligar a fibronectina, laminina e colágeno do tipo I. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensis com anticorpo anti-GAPDH, quanto de pneumócitos tratados com a GAPDH recombinante, promoveram a inibição da aderência e internalização de P. brasiliensis à células cultivadas in vitro (pneumócitos). Essas observações indicam que a GAPDH possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causing paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensis was isolated from gel after two dimensional electrophoresis and characterized. Endoproteinase Lys-C-digest peptides of the purified protein, which presented a molecular mass of 36 kDa and pI 6.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH: EC 1.2.1.12) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbGAPDH were obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 338 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbGAPDH. The Pbgapdh gene contained 5 exons interrupted by 4 introns. Analysis performed with the deduced PbGAPDH suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and introns positions in the cognate genes. The expression of Pbgapdh was analyzed and a single species of mRNA, of 2.0 Kb, preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis, was detected in agreement to the high levels of the GAPDH expression in the yeast cells of P. brasiliensis. The purified recombinant GAPDH was used to produce policlonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, GAPDH was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The recombinant GAPDH was found to bind to fibronectin, laminin, and type I collagen in ligand far-Western blot assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensis yeast cells with anti-GAPDH polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensis to those in vitro cultured cells. These observations indicate that GAPDH could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection.