Recuperação e criopreservação de germoplasma de mamíferos silvestres mortos no bioma Cerrado do Distrito Federal : uma estratégia para conservação animal ex situ

Abstract

A perda da diversidade biológica vem aumentando consideravelmente no bioma Cerrado, sendo causada pela destruição de hábitats ocasionados pelo crescimento das cidades, fronteiras agrícolas, aumento da população humana, extração de madeira, abertura de estradas e distúrbios como fogo, caça, pecuária e, sobretudo, atropelamentos de animais silvestres em rodovias. Com essa intensa perda de material genético, fez-se necessário a criação de um banco de germoplasma para se evitar a extinção de espécies ameaçadas. O objetivo deste trabalho foi primeiramente avaliar a possibilidade de recuperar, isolar e caracterizar fibroblastos de três espécies diferentes (lobo-guará, veado-catingueiro e cachorrodo- mato), assim como testar o efeito dos crioprotetores DMSO 10% e DMF 5% associados a uma curva de resfriamento lenta e não controlada, sobre a viabilidade celular destes animais. Em seguida, utilizando o meio de criopreservação mais eficiente identificado previamente, formar um banco de germoplasma contendo fibroblastos de diferentes espécies silvestres do bioma Cerrado, aproveitando o material genético que seria perdido com a morte do animal. Os animais foram provenientes de atropelamento nas rodovias, encontrados mortos no meio ambiente ou do Hospital Veterinário do Jardim Zoológico de Brasília. Foram retirados fragmentos de pele da orelha dos animais mortos. Em seguida foram tricotomizados e fragmentados em pedaços de 2 mm2. As amostras foram colocadas em placas de petri, preenchidas com 3 mL de meio DMEM, suplementado com 10% de SFB e antibiótico e, em seguida levadas à estufa de CO2 a 38,5 ºC e 5% de CO2. Os fragmentos foram retirados após 10 dias após a troca do meio. No sétimo dia após a troca do meio, as células foram suspensas em tripsina-EDTA e transferidas para garrafas de cultivo até atingirem a confluência. Após atingirem a terceira passagem, uma parte das células foi diluída em solução de criopreservação com 10% de DMSO, e a outra parte foi diluída em solução com 5% de DMF. As células foram envasadas em palhetas de 0,25 mL e armazenadas por 24 horas a -80ºC e, logo após esse tempo, armazenadas em nitrogênio líquido. As células pós-congelamento foram coradas com Trypan blue 4% para análise de viabilidade. Os fibroblastos dos exemplares de lobo-guará apresentaram um atraso no crescimento celular em meio DMEM em relação a outras espécies, sendo um fator limitante para seu armazenamento futuro. Diferenças na morfologia celular foram observadas entre os fibroblastos de lobo-guará, veado-catingueiro e cachorro-do-mato, que apresentaram formato ramificado, fusiforme e esférico, respectivamente. A solução de crioproteção contendo 10% de DMSO foi mais eficiente que o meio com DMF 5%, para conservar a viabilidade dos fibroblastos das três espécies (P<0,05). Um banco de germoplasma foi formado com 508 amostras criopreservadas com fibroblastos de 19 animais, provenientes de 11 espécies diferentes. Dentro destas espécies, quatro são classificadas em escala de risco de extinção como menos preocupantes (cachorro-do-mato, veado-catingueiro, furão e macaco-da-noite), seis espécies como vulneráveis (lobo-guará, onça-pintada-preta, onça-pintada, gato-maracajá e gato-palheiro), uma em perigo de extinção (mico-leão-preto) e uma criticamente em perigo (cairara). Este reservatório biológico se configura no primeiro banco de germoplasma contendo células somáticas de mamíferos silvestres mortos do bioma Cerrado do Brasil. Este material está alocado no Jardim Zoológico de Brasília e servirá para estudos futuros de caracterização das espécies e multiplicação de animais por meio da clonagem por transferência nuclear.