Prospecção de moléculas-alvo para intervenção da interação planta-praga

Abstract

O nematóide formador de galhas Meloidogyne incognita ("southern root-knot nematode", SRN) apresenta distribuição mundial, causando grandes perdas em várias culturas. Seu ciclo de vida compreende seis estádios de desenvolvimento (ovo, larva 1-4 e adulto). A larva L2, fase infectiva, penetra na raiz de planta hospedeira por força mecânica e degradação enzimática para, então, estabelecer a interação planta-patógeno. Em condições favoráveis, as larvas L2 se diferenciam em fêmeas adultas apomíticas, que completam o ciclo de vida após a deposição de mais de 2000 ovos. As práticas agrícolas atuais não são eficientes contra os fitonematóides, de modo que uma estratégia poderosa e promissora para o controle de nematóides é a produção de plantas transgênicas expressando moléculas que afetam o parasitismo. Proteinases são importantes alvos para o controle de nematóides e o primeiro capítulo descreve um estudo das ESTs codificadoras de aspártico, serino e cisteíno proteinases disponíveis em banco de dados, além da completa caracterização de cDNAs isolados anteriormente. Parece existir um abundância de ESTs de aspártico proteinases em fase larval, quando comparado com ovos e fêmeas. Apenas em bibliotecas de ovos se encontram ESTs de serino proteinase. Por outro lado, ESTs de cisteíno proteinase são as mais abundantes e são encontradas em todas as fases. O cDNA Mi-asp1 codifica uma catepsina D-tipo com vários ortólogos conhecidos em nematóides. Análises de expressão temporal e espacial mostram que Mi-asp1 seja mais transcrito em ovos, do que larvas L2 ou fêmeas, sugerindo um importante papel na embriogênese do nematóide. Já no segundo capítulo, objetivando a identificação de genes envolvidos na infecção e nos processos vitais, uma biblioteca de cDNAs foi construída a partir de mRNA de larvas L2, usando o "Superscript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning" (Invitrogen). A biblioteca de ESTs apresentou 2.137 seqüências validadas com 17% de redundância, distribuídas em 1.506 singlets e 197 contigs, gerados de 631 ESTs. A anotação gênica foi obtida por comparação dos resultados do BLASTx (GenBank). A análise in silico das seqüências obtidas foi feita para predição funcional, agrupamento filogenético, predição de transferência horizontal gênica e determinação da importância na interação planta-patógeno. A predição da função gênica por classificação em categorias KOG demonstrou que várias seqüências são relacionadas com mecanismos de transdução de sinais (13%) e modificações pós-traducionais, renovação de proteínas, chaperonas (12%). Os trabalhos de validação de genes-alvo estão em andamento e incluem ensaios in vitro, in vivo e in planta. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The southern root-knot nematode Meloidogyne incognita (SRN) is worldwide distributed, causing great losses in several crops. Its life cycle comprises six developmental stages (egg, four juveniles and adult). The infective stage larva 2 (L2) enters the host root via mechanical force and enzymatic degradation, and establishes the host-pathogen interaction. Under favorable parasitism conditions the L2 differentiates into an apomitic female adult that resumes its life cycle by depositing up to 2000 eggs. Current agronomic traits are not effective against the SRN, so, a powerful and promising strategy to the nematode control is the production of transgenic plants expressing molecules that are able to hinder the infection process. In this way, the promising one is the anti-feeding strategy based upon digestive enzymes inhibition and the first chapter shows an analysis of EST encoding proteinase from the data bank, beyond the complete characterization of isolated cDNAs. Aspartic proteinase ESTs are more abundant in larval stages than eggs or females. Only eggs library showed serine proteinase ESTs. On the other hand, cysteine proteinase ESTs are the most abundant and are found in all life stages. The Mi-asp1 cDNA encodes a cathepsin D-like with several known nematode orthologues. Temporal and spatial expression analysis showed that Mi-asp1 is most transcribed in eggs than larva L2 or female, suggesting an important role during nematode embryogenesis. In the second chapter, in order to identify the genes involved in the infection and other vital processes, a cDNAs library was constructed from L2 mRNAs using the Superscript Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis and Cloning (Invitrogen). Up to the moment, the L2 cDNA library was constructed, in which 2,137 valid sequences with 17% of redundancy, distributed in 1,506 singlets and 197 contigs, generated with 631 sequences. Sequence annotation was obtained by comparing BLASTx results (GenBank). In silico analysis of obtained sequences were performed functional prediction, phylogenetic grouping, horizontal-transferred genes prediction and determination of plant- pathogen interaction. Prediction of gene function by KOG categories classification demonstrated that several sequences are related to signal transduction mechanisms (13%) and postranslational modification, protein turnover, chaperones (12%). Validation works are in test and include in vitro, in vivo and in planta assays.