Avaliação da citotoxicidade do extrato de semente de uva em cultura de células pulpares

Abstract

O presente estudo avaliou o efeito citotóxico do extrato de semente de uva (ESU) em contato direto e transdentinário com células de cultura primária de polpa humana, em diferentes concentrações e tempo de exposição. Células pulpares assim como discos de dentina foram obtidas a partir de terceiros molares de adultos com idades entre 18 e 25 anos. Culturas primárias foram estabelecidas e cultivadas até a obtenção do número adequado de células. O ESU foi diluído previamente ao início de cada experimento. Após a quarta passagem, no teste de contato direto, dez mil células foram semeadas em placas de 96 poços e após 24 horas receberam os tratamentos. Na primeira fase, testou-se diferentes concentrações formando os seguintes grupos: G1: controle negativo celular (D-MEM); G2: controle negativo de tratamento (Hepes); G3: 6,5% de ESU; G4: 0,65% de ESU; G5: 0,065% de ESU; G6: 0,0065% de ESU; G7: controle positivo com peróxido (H2O2 a 20%). Após uma hora de contato, as soluções experimentais foram removidas e novo meio de cultivo (DMEM) foi adicionado. Na segunda fase foram testados diferentes tempos de exposição das melhores concentrações da “fase 1” (0,65% ESU e 0,0065% ESU). Para tal os grupos experimentais foram: G1: controle celular (DMEM) por 1 hora, G2: controle de tratamento (Hepes) por 1 hora, G3: ESU por 1 hora, G4: ESU por 30 minutos, G5: ESU por 10 minutos, G6: ESU por 1 minuto, G7: controle peróxido (H2O2 a 20%) em contato por 1 hora. No teste transdentinário, foram semeadas cinquenta mil células em discos de dentina adaptados a um dispositivo de câmara pulpar artificial em placas de 24 poços. Os seguintes grupos permaneceram por 24h em contato com o ESU: G1: controle negativo celular (D-MEM); G2: controle negativo de tratamento (Hepes); G3: 0,65% de ESU; G4: controle peróxido (H2O2 a 20%). Transcorridos os tempos experimentais de contato, as soluções testadas foram removidas e novo meio de cultivo (DMEM) foi adicionado. Para compor a analise de citotoxicidade, o metabolismo celular foi avaliado por meio do teste de produção de desidrogenase succínica (MTT) 24 e 72 horas após o tratamento; o estresse oxidativo foi avaliado por meio do ensaio de óxido nítrico (ON) 24 e 72h após os tratamentos, e foi realizada microscopia eletrônica de varredura para ilustração dos melhores grupos. Os resultados foram analisados por testes paramétricos (ANOVA e Tukey) ou nao paramétricos (Kruskall-Wallis e Mann-Whitney; α=0,05). De acordo com os dados obtidos, foi possível observar que a menor concentração de extrato de uva testada (0.0065%) apresentou resultados favoráveis tanto para o metabolismo celular, com um aumento no período de 24 horas, quanto a produção de ON, com redução dessa produção no período de 72 horas. Nenhuma resultou em redução do metabolismo celular maior que 10% do controle, indicando a não toxicidade desse extrato tanto aplicado diretamente sobre a cultura primaria de células pulpares quanto na presença de barreira dentinária.O ESU foi capaz de estimular o metabolismo celular sem levar a um aumento do estresse oxidativo em todos os tempos avaliados e mesmo na menor concentração, sugerindo uma potencial bioatividade deste agente crosslinker sobre células pulpares.