Soybean seed galactinol synthase activity as determined by a novel colorimetric assay

Abstract

Galactinol sintase (GS) é a enzima-chave para a biossíntese de oligosacarídeos de rafinose (RO), que são os fatores antinutricionais causadores de flatulência, os quais estão presentes em sementes de soja e em outros legumes. A GS catalisa a formação de galactinol e UDP a partir de UDP-gal e mioinositol. A atividade dessa enzima é determinada atualmente pelo método radioisotópico que, apesar de adequado tecnicamente, apresenta vários inconvenientes, tais como a necessidade de substrato de alto custo, bem como de cuidados adicionais e serviços especializados para descarte dos resíduos radioativos. Assim, desenvolveu-se um método colorimétrico alternativo ao método radioisotópico, baseado na determinação colorimétrica indireta do UDP formado pela hidrólise enzimática (apirase) desse nucleotídeo e determinação do Pi resultante pelo método de Fiske & SubbaRow, com modificações. A cor desenvolvida é estável e o método é sensível para detecção de quantidades nanomolares de Pi. Os perfis de atividade da GS em sementes de soja em diferentes fases de desenvolvimento, determinados pelos métodos colorimétrico e radioisotópico, são semelhantes. Adicionalmente, a GS de sementes de soja foi purificada (46-vezes) por tratamento do extrato das sementes com MnCl2, e uma seqüência de cromatografias em colunas de DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose CL-4B e Q-Sepharose. As atividades de GS no extrato bruto e na amostra parcialmente purificada foram máximas em pH 7.0 e 50 ºC. Ditiotreitol e MnCl2 aumentaram consideravelmente a atividade da enzima parcialmente purificada. Enquanto UDP-glc pode ser hidrolisado pela enzima com uma atividade relativa correspondendo a 49% da atividade contra UDP-gal, UDP-man e sacarose foram completamente ineficazes como substratos alternativos. Os valores de K M para conversão de UDP-gal e mio-inositol foram de 2,0 mM e 2,93 mM, respectivamente, determinados pelo método de Lineaweaver-Burk.