Expressão e purificação de histonas humanas recombinantes

Abstract

O DNA de organismos eucarióticos é organizado sob a forma de cromatina, sendo responsável pela regulação da transcrição, replicação e reparo do DNA. O nucleossomo, unidade fundamental da cromatina, compreende estrutura formada por uma sequência de DNA enrolada no octâmero de histonas, chegando a altos níveis de compactação que dão origem ao cromossomo. Para o estudo da estrutura do nucleossomo, é imprescindível a sua reconstituição in vitro, na qual faz-se necessário um método eficiente para a obtenção de histonas recombinantes. Existem diversos protocolos para expressão e purificação de histonas recombinantes publicados na literatura. Portanto, o objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo para obtenção de histonas canônicas recombinantes. Para estabelecimento do protocolo de expressão, duas cepas competentes de E. coli (Rosetta gami e Rosetta pLysS) foram testadas quanto a capacidade de produzir grande quantidade de histona recombinante por duas diferentes metodologias: expressão clássica com uso de IPTG e expressão espontânea. As histonas foram purificadas por extração de corpos de inclusão seguido por cromatografia de troca iônica. Surpreendentemente, os melhores resultados de expressão, para todas as histonas, foram obtidos pela metodologia de auto-expressão com uso de Rosetta pLysS. No entanto, com exceção da H3, bons resultados também foram adquiridos por expressão clássica com IPTG. Ajustes no protocolo de purificação foram realizados de forma a reduzir a degradação por proteases, grande desafio encontrado nesta etapa. A utilização de associação de inibidores favoreceu a modulação desta degradação. Assim, foi possível estabelecer um método para expressão e purificação de histonas de forma a obter grande quantidade de histona recombinante livres de degradação.