Avaliação de duas ORFs pertencentes ao cluster de produção de lovastatina em Aspergillus terreus

Abstract

Aspergillus terreus é um fungo filamentoso de importância biotecnológica por ser produtor de enzimas de interesse comercial, além de metabolitos secundários como a lovastatina. Esta é utilizada no tratamento de pessoas com hipercolesterolemia uma vez que é um inibidor competitivo da HMG-CoA redutase, enzima responsável pela conversão de HMG-CoA em Mevalonato, diminuindo assim a síntese de colesterol endógeno. Os 18 genes codificadores de enzimas envolvidas na via biosintética de lovastatina estão organizados em um agrupamento gênico de 65 kb no genoma de A. terreus. Dentre esses, genes essenciais já foram identificados, como os genes lovB e lovF, que codificam as principais enzimas da via. Apesar de vários estudos a respeito da via biosintética de lovastatina, ainda existem 10 genes do cluster com a função desconhecida ou predita. Dentre eles a ORF8 (open Reading frame), anotada como um possível gene de resistência. Análises de similaridades mostraram que esta ORF codifica para uma HMG-CoA redutase, sendo que o fungo ainda tem outras duas regiões fora do cluster de lovastatina que também codificam HMG-CoA redutase. Alinhando as três sequências, a ORF8 e as duas enzimas de fora do cluster, foi possível observar que a HMG-CoA redutase, codificada pela ORF8, possui duas mutações no sítio de ligação. Assim, para a caracterização da HMG-CoA redutase, que a ORF8 codifica, foi clonada a sequência no plasmídeo pET28a para expressa-la em Escherichia coli. O plasmídeo foi inserido em quatro linhagens de E. coli, nas quais não foi observada a expressão da proteína. Assim foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores para que a ORF8 fosse clonada no vetor p416TEF, que possui a marca de seleção auxotrófica URA3 para inserção na levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto foi possível detectar a produção da enzima em S. cerevisiae pois a ligação do vetor e o inserto não foi alcançada. Outra ORF com função predita é a ORF10, anotada como um possível transportador de lovastatina. Dessa forma, para confirmar sua função biológica, foi realizada sua deleção na cepa ATCC20542, usada como referência para produção de lovastatina. A montagem do cassete de deleção foi realizada em 2 partes, sendo a primeira a amplificação por PCR do cassete de resistência a Higromicina B e dos fragmentos que flanqueiam o gene; e a segunda a fusão dos três fragmentos utilizando a técnica de PCR. O cassete de deleção foi utilizado na transformação da cepa de A. terreus ATCC20542, usada como referência para produção de lovastatina. Após os experimentos de transformação, os 17 clones obtidos foram cultivados em meio definido para quantificação da produção de lovastatina, tanto em sobrenadante quanto em micélio. Dentre os clones avaliados, em 4 clones não foi possível detectar lovastatina no sobrenadante, já em micélio foi observada uma redução de aproximadamente 60% de lovastatina produzida. Estes 4 clones tiveram então seu DNA genômico extraído e usado como molde em reações de PCR. Dessa foram foi possível confirmar que a ORF10 estava realmente deletada nas cepas cuja produção de lovastatina no sobrenadante foi eliminada evidenciando experimentalmente que essa ORF está, de fato, relacionada ao transporte de lovastatina.