Proteassoma 20S de Saccharomyces cerevisiae em complexo com o inibidor de serinoproteases BTCI de Vigna unguiculata

Abstract

O proteassoma é um complexo enzimático multicatalítico responsável por processos de degradação proteica e pela manutenção da homeostase celular. A inibição do proteassoma induz a diminuição da progressão de processo tumoral por induzir a apoptose das células cancerígenas. Têm-se caracterizado os inibidores de serinoproteases da família Bowman-Birk como potentes agentes anticancerígenos, sendo parte desse efeito consequência da inibição do proteassoma 20S. O inibidor de tripsina e quimotripsina pertencente à família Bowman-Birk denominado black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibtor (BTCI), isolado de sementes de Vigna unguiculata, possui ação anticancerígena às células de câncer de mama devido a capacidade de inibir o proteassoma 20S. Neste trabalho, estudos de interação entre o BTCI e o proteassoma, por métodos físico-químicos foram propostos visando caracterizar a estequiometria e os parâmetros termodinâmicos dessa interação. O BTCI foi purificado por cromatografia de troca iônica a partir do extrato bruto de sementes de V. unguiculata. O proteassoma foi obtido da linhagem RJD1144 de Saccharomyces cerevisiae, por cromatografia de afinidade a níquel, seguido de uma cromatografia de troca aniônica. Foram realizados os ensaios de inibição da atividade proteolítica do proteassoma 20S na presença do BTCI, análises de caracterização físico-química e estrutural do BTCI, do proteassoma 20S e do complexo BTCI-proteassoma por ultracentrifugação analítica e ensaios de calorimetria com as duas proteínas, possibilitando mensurar os parâmetros termodinâmicos e a estequiometria da interação do proteassoma 20S com o BTCI. Os valores de Ki obtidos pelos ensaios de inibição a 31 ºC, 34 ºC e 46 ºC foram, respectivamente, iguais a 2,72 ± 0,28 x 10-5 M, 2,97 ± 0.12 x 10-5 M e 1,940 ± 0,004 x 10-6 M. Resultados obtidos por ultracentrifugação analítica sugerem a formação do complexo BTCI-proteassoma 20S com uma estequiometria de 4,2 moléculas de inibidor para cada proteassoma. Para o ensaio de calorimetria realizado a 30ºC, a constante de afinidade obtida foi 1.34 x108 6.42 x107 M-1, e os parâmetros termodinâmicos obtidos foram ΔH, 1.888 x105 1.191 x104 cal/mol, ΔS, 660 cal/mol/deg, e ΔG, -11,1 Kcal.mol-1. A estequiometria estimada por calorimetria foi de 5,3 moléculas de BTCI para cada molécula de proteassoma 20S. Os valores estequiométricos obtidos por calorimetria (ITC) e ultracentrifugação analítica sugerem a ideia da formação do complexo molecular com 4 a 5 moléculas de BTCI para cada proteassoma, sendo formado por processo endotérmico (ΔH>0), entropicamente favorável (ΔS>0) e espontâneo (ΔG<0). A contribuição do fator entrópico (T. S), maior que a variação da entalpia, foi determinante para a espontaneidade da reação.