Identificação e caracterização de uma proteína com motivos ZINC FINGER de Trypanosoma cruzi

Abstract

Proteínas zinc finger são compostas por domínios compactados contendo α- hélices e folhas β unidos e estabilizados por um ou dois átomos de zinco. Arranjos repetidos de zinc fingers são comumente utilizados para reconhecimento de ácidos nucléicos. Dentre outras atividades, eles estão envolvidos em replicação, transcrição e reparo de DNA. No nucleocapsídeo do vírus HIV tipo 1 foi identificada uma proteína contendo o motivo zinc finger CX2CX4HX4C, estando esta proteína envolvida em várias etapas do ciclo de vida viral, incluindo a propriedade de encapsidação do RNA viral. Em tripanosomatídeos, somente poucas proteínas contendo o motivo zinc finger já foram identificadas até o presente momento. Em um fragmento genômico de 17 kb da banda XX de T. cruzi, nós identificamos três genes in tandem codificando para proteínas zinc finger do tipo CX2CX2HX4C. Nós também demonstramos que genes similares estão presentes em T. brucei e L. major como três definidos grupos monofiléticos entre esses tripanosomatídeos. Em T. cruzi, TcZFP8 corresponde a um novo gene codificando para uma proteína com oito motivos zinc finger. O homólogo de TcZFP8 em T. brucei é aparentemente ausente, enquanto um candidato foi identificado em L. major. A clonagem molecular e a expressão heteróloga de TcZFP8 foi realizada para produção de anticorpos e procedimentos como imunocitolocalização, SELEX e EMSA. Análise por Western blotting revelou a presença dessa proteína nas três formas do parasita. Análises usando extratos protéicos nucleares e citoplasmáticos de T.cruzi mostraram que essa proteína está presente na porção nuclear. Esse resultado foi confirmado através de análise de microscopia por imunofluorescência indireta. Experimento de SELEX demonstrou quatro diferentes populações com uma região interna rica em C e/ou G, porém sem seqüências consenso específicas. Análises preliminares de EMSA de uma das quatro populações selecionadas revelaram evidências de que TcZPP8 possa ter afinidade de ligação à fita simples de DNA. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Zinc fingers are compact protein domains composed of a α-helix and a β-sheet held together by a zinc ion. Tandem arrays of zinc fingers are commonly used to recognize nucleic acids. Among other activities, they are involved in the processes of replication, transcription, and DNA repair. The nucleocapsid protein of HIV-1 contains a zinc finger motif CX2CX4HX4C that contributes to multiple steps of the viral life cycle, including the proper encapsidation of HIV RNA. In trypanosomatids, only a few of the proteins that contain such fingers were identified. In a 17-kb genomic fragment of Trypanosoma cruzi chromosome XX we identified three tandemly linked genes coding for CX2CX4HX4C zinc finger proteins. We also showed that similar genes are present in Trypanosoma brucei and Leishmania major sharing three monophyletic groups among these trypanosomatids. In T. cruzi, TcZFP8 corresponds to a novel gene coding for a protein containing eight zinc finger motifs. Homologous of TcZFP8 in T. brucei is apparently absent, while one candidate in L. major was identified. Molecular cloning of gene TcZFP8 and heterologous expression were performed in Escherichia coli. The purified recombinant protein His6x-TcZFP8 was used to produce antibody in rabbits and GST-TcZFP8 in SELEX and EMSA procedures. Using Western blot analysis, we observed the presence of this protein in all three forms of the parasite: amastigote, trypomastigote and epimastigote. Analysis using cytoplasm and nuclear cell extracts showed that this protein is present in the nuclear extracts and indirect immunofluorescence microscopy analysis confirmed the nuclear localization of the TcZFP8. SELEX experiment showed four different populations rich in C and/or G nucleotides, but with none consensus sequence. Preliminary EMSA from one population gave evidence that TcZFP8 has affinity to bind to singlestranded DNA.