Estratégias para a conservação ex situ de Dendrocalamus asper e micropropagação de espécies do gênero Guadua (Bambusoideae, Poaceae)

Abstract

Neste trabalho foram estudadas três espécies de bambus lenhosos sendo uma espécie nativa da Ásia (Dendrocalamus asper), uma nativa das Américas (Guadua angustifolia) e a última endêmica da região Centro-oeste (Guadua magna), com o objetivo de elucidar questões sobre a germinação, conservação ex situ e micropropagação. Dessa forma, referente as sementes e a germinação de D. asper, foram realizados estudos de germinação em papel germitest, substrato Bioplant e meio de cultivo de MS em duas condições de luminosidade: claro e escuro. Também foram realizados testes para desinfestação de sementes com NaOCl2 e HgCl2. Além da avaliação da germinação em tubos de ensaio com de MS semissólido e em biorreatores RITA com meio de MS liquido com adição (Sac+) ou não (Sac-) ao meio. Como resultado o meio de cultivo in vitro aliado a desinfestação com cloreto de mercúrio foi o mais promissor para germinação de D. asper independente das condições de luminosidade. Após a germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas com três fenótipos distintos (verde, variegado e albino), quantificou-se o DNA nuclear através de citometria de fluxo e os fenótipos não apresentaram diferenças na quantidade de DNA. Durante a germinação e desenvolvimento pós-seminal, também realizou-se a caracterização anatômica, histoquímica e análise bioquímicas, constatando-se que as sementes desta espécie possuem endosperma amiláceo, camada de aleurona e embrião maduro bem desenvolvido. Sendo o amido o metabólito mais abundante, seguido por proteínas e lipídeos. Para o protocolo de criopreservação, sementes de D. asper foram dessecadas por 0, 24, 48, 96 e 144 horas em dessecador. Ao término de cada período de dessecação as sementes foram divididas em três partes: uma parte foi seca em estufa por 24 horas para medir o teor de umidade; a segunda parte foi colocada para germinar em meio de MS e a terceira parte foi imersa em nitrogênio líquido (-196 ºC) por 48 horas, depois desse período foram descongeladas e inoculadas em meio de MS. A dessecação de sementes por até 144 horas garantiu um teor de umidade de cerca de 5% e não influenciou na germinabilidade tanto em nenhum dos tratamentos (-NL e +NL), o que indica o possível comportamento ortodoxo destas sementes. A conservação ex vitro foi realizada a partir do armazenamento de sementes sob as temperaturas de 25 (controle), 6, -20 e -196 ºC por 0, 30, 90, 180, 360 e 600 dias. Após cada período de armazenamento as sementes foram inoculadas em tubos com meio de MS. As plantas obtidas da germinação foram aclimatizadas. Nos períodos de armazenamento de 0, 360 e 600 dias foram coletadas sementes para realização de análises bioquímicas, onde quantificou-se amido, proteínas e lipídeos. Sementes de D. asper mantem sua viabilidade por até 600 dias quando conservadas nas temperaturas de -20 ºC e -196 ºC, enquanto na temperatura de 25 ºC ocorre decréscimo acentuado da viabilidade aos 600 dias, além de ocorrer o desenvolvimento anormal de plantas. A análise da composição bioquímica das sementes conservadas corroborou com os resultados obtidos no experimento de germinação, apresentando poucas diferenças para os metabólitos entre os períodos de armazenamento. Para as espécies G. magna e G. angustifolia objetivou-se desenvolver um protocolo de micropropagação completo, a partir de mudas mantidas em casa de vegetação onde foram tratadas ou não com fungicida Mythos. Em laboratório, para etapa de estabelecimento segmentos nodais foram inoculados em meio de MS com diferentes formulações: MS normal; MS com 3,0 m.L-1 de PPM e MS com 1 m.L.L-1 de fungicida Carbendazin. A adição de Carbendazin e PPM ao meio, reduziram a contaminação em G. magna e não influenciaram a taxa de contaminação e brotação em G. agustifolia. Em seguida, as brotações obtidas da etapa de estabelecimento que estavam livres de contaminação, foram multiplicadas em meio de MS com 3,0 mg.L-1 de BAP em duas consistências: líquida e semissólida por cinco subcultivos e ao final desse período realizou-se a verificação da fidelidade genética dos clones através de marcadores ISSR. De maneira geral, o meio líquido se mostrou mais eficiente em comparação ao meio semissólido para as duas espécies estudas e o uso de marcadores ISSR, permitiu verificar a similaridade de 87% entre as duas espécies e ausência de polimorfismo entre os clones obtidos durante a multiplicação em ML e MSS. O enraizamento foi realizado em meio MS1/2 acrescido de 3,0 mg.L-1 de AIB também nas consistências: liquida e semissólida. Em seguida as plantas foram aclimatizadas em substrato Bioplant e câmara de crescimento BOD. No enraizamento, a adição de 3,0 mg.L-1 de AIB no meio líquido ou semissólido possibilitou um enraizamento de 45% no ML e 30% no MSS para G. magna e 53% ML e 62% MSS para G. angustifolia. Para o desenvolvimento de um protocolo completo de micropropagação para G. magna, foram utilizadas sementes coletadas em áreas naturais, que foram desinfestadas com hipoclorito de sódio (NaOCl2), cloreto de mercúrio (HgCl2) e/ou fungicida sistêmico Carbendazin isolados ou em combinação e adicionados ao meio de cultivo. O hipoclorito de sódio, cloreto de mercúrio e fungicida sistêmico Carbendazin podem ser utilizados para desinfestação de sementes e no meio de cultivo sem interferir na germinação. Para a multiplicação foram avaliadas as citocininas CKs: 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (Kn) e metatopolina (mT) nas concentrações 0,0; 6,66, 13,32, 19,98 e 26,64 μM em meio de MS líquido. Ao final desta etapa realizou-se a quantificação de clorofila e a análise de fidelidade genética com auxílio de marcadores ISSR para os melhores tratamentos. Também foram avaliados os sistemas de cultivo MSS, MLE e MLA com 6,66 μM de mT e explantes de diferentes posições do broto (1º nó, 2º nó, 3º nó, base do broto e broto inicial). Durante a multiplicação a citocinina mT na concentração de 6,66 μM, explantes da base, do broto e o meio líquido possibilitam as melhores taxas de multiplicação. Brotações oriundas de meio de multiplicação com Kn apresentaram menores teores de clorofila. A realização de cinco subcultivos, não induziu a ocorrência e variações somaclonais nas brotações de G. magna. O enraizamento de microestacas foi realizado em meio de MS semissólido com as auxinas ácido indolacético (AIA), ácido naftalenoacético (ANA) e ácido indolbutírico (AIB) nas concentrações 0,0; 1,23; 2,45; 4,90; 9,80 e 14,70 μM. Também foram avaliadas as concentrações do meio de MS (MS1/4, MS1/2, MS3/4 e MS) e explantes de diferentes posições do broto (1º nó, 2º nó, 3º nó, base do broto e broto inicial). Ao final da etapa de enraizamento as plantas foram aclimatizadas e avaliou-se a sobrevivência. Para o enraizamento a auxina AIB na concentração 4,90 μM induziu a melhor taxa de enraizamento. Enquanto a utilização de brotos iniciais como explante em meio de MS em qualquer concentração (MS1/4, MS1/2, MS3/4 e MS) também induziram boas taxas de enraizamento. Para todos os experimentos de aclimatização plantas inteiras com raízes e parte aérea bem desenvolvidos apresentam até 100% de sobrevivência.