Structural and functional characterization of novel lipolytic enzymes from a brazilian Cerrado soil metagenomic library

Abstract

O solo do Cerrado tem sido foco de poucos estudos, especificamente sua diversidade microbiana. O solo é um habitat com alta diversidade de microrganismos e, portanto, pode ser fonte para a prospecção de enzimas industriais. A identificação de novos genes pela abordagem metagenômica levou à descoberta de novas atividades enzimáticas. As enzimas lipoliticas são produzidas principalmente por microorganismos, frequentemente bactérias, e desempenham um papel vital em iniciativas comerciais. A fim de isolar genes putativos de lipase, foi realizado um screening com tributirina em uma biblioteca metagenômica de solo de Cerrado. De 6.720 clones avaliados contendo um inserto de mediana de 8 Kb, foram isolados três com atividade lipolítica e dezoito seqüências codificantes foram preditas. LipX e lipY se agruparam a enzimas da família IV lipolítica, relacionados com lipase de Pseudomonas sp. (AAC38151), Cupriavidus necator (AAC 41424) e Moraxella sp. (CAA37862). LipW apresentou semelhanças estruturais com uma enzima lipolítica de Pseudomonas fluorescens e 28% de identidade de sequência, no mesmo ramo de quatro lipases / esterases da bactéria Moraxellaceae. Além disso, a tríade catalítica Ser-Asp-His foi localizada no motivo G-X-S-M-G-G, similar a outras lipases da família V. A purificação da lipX revelou uma proteína recombinante de 35 kDa, e da lipY revelou uma proteína recombinante de 32 kDa como previsto pelos dados de sequenciamento. O peso molecular estimado do LipW foi de 29 kDa, os parâmetros moleculares puderam ser associados ao monômero do lipW em correspondência com o seu MW teórico, como também se observou no gel de SDS-PAGE. A atividade enzimática foi observada de pH 3,0 a 10,0, com atividade ótima em pH 7,5,0-9,5 para lipX, pH 8,0-9,5 para lipY e em pH 9,0-9,5 para lipW. Dentro da faixa de temperatura de 25°C-95°C, a atividade máxima foi observada a 55°C para lipX, 60°C para lipY e 40°C para lipW. Os resultados da comparação entre o lipX com o algoritmo BLAST e o banco de dados de proteínas (PDB) exibiu 41% de identidade com mutante G84S EST2 de Alicyclobacillus acidocaldarius [PDB 2HM7] e dobra α/βhydrolase da família sensível ao hormônio IV Esterase/Lipase. Com os resíduos catalíticos: Ser156, Asp259 e His289 localizados entre o domínio α/β e o domínio helicoidal. O Ser156 está localizado no motivo de consenso GDSAGG, e também foi visto no alinhamento de sequência de lipX com outros membros da família IV. LipY tem uma tríade catalítica formada por Ser143, Glu237 e His267. LipY também contém um domínio CAP (Met1–Val45) além do domínio catalítico (Gln46–Arg306). O Ser143 catalítico está localizado no motivo GXSAG semi-conservado onde, em vez de Asp (GDSAG), o mais comum, há outro resíduo de carga negativa, Glu (GESAG). LipX e lipY contêm motivo HGG conservado, que está envolvido na formação do canal oxianionico. Juntos, os espectros de CD UV distante e a estrutura do modelo 3D baseada na modelagem por homologia indicam que a estrutura secundária lipX, Y e W consistia em α-hélice (~45%) e estruturas de folha-β (~15%), o que é consistente com a estrutura secundária predominantemente α-hélice da família α/β-hidrolase de esterases. A combinação de propriedades estruturais e funcionais demonstra que a abordagem metagenômica de ambientes nativos é adequada para descobrir novas enzimas lipolíticas com aplicação biotecnológica.