Efeito antimicrobiano e citolítico da trialisina recombinante da saliva de Triatoma infestans

Abstract

Insetos hematófagos têm grande interesse médico-biológico devido a transmissão de doenças endêmicas de alta prevalência, morbidade e mortalidade em populações humanas e de animais, em todos os continentes. Por exemplo, a doença de Chagas transmitida pelo triatomineo Triatoma. infestans está amplamente distribuída no continente americano, onde cerca de 18 milhões de pessoas já estariam infectadas com o Trypanossoma. cruzi, o agente causai da doença. Esses insetos produzem e armazenam proteínas farmacologicamente ativas em suas glândulas salivares, e as inoculam no hospedeiro durante o repasto. Ao inibir os mecanismos homeostásicos da sua presa, essas bioaminas facilitam o repasto do inseto e a transmissão do agente patógeno. O estudo de proteínas salivares com notável efeito farmacológico pode ser útil no estudo da filogenia e diversidade genética de insetos, mas elas também poderiam ser usadas como ferramentas para a caracterização dos processos hematológicos, vasculares, e teciduais relacionados às modificações que ocorrem no sítio da picada. Contudo, nós achamos que, igualmente importante, seria a produção de uma vacina contra a picada do inseto hematófago, criando imunoprofilaxia contra a transmissão do T. cruzi. A produção de vacina com proteínas recombinantes expressas na glândula salivar do triatomineo é um objetivo em longo prazo no Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas. O trabalho aqui apresentado faz parte dessa estratégia visando á identificação de genes e expressão de proteínas recombinantes com funções importantes no repasto do inseto, Nós analisamos 20 clones oriundos de uma biblioteca de cDNA de glândula salivar de T. infestans. As seqüências gênicas desses clones mostraram similaridade, e não descartamos a possibilidade de se tratar de uma família mulíigênica. A proteína recombinaníe resultante da expressão do clone 30/LMPDC recebeu o nome de rTrialisina. Ainda que a seqüência do clone 30/LMPDC tenha 97% de similaridade com o gene da Trialisina (Amino e cols., 2002), nós obtivemos a expressão da rTrialisina e descrevemos suas características funcionais ainda desconhecidas. Ademais, a modelagem molecular permitiu-nos conhecer parte da estrutura terciária da proteína e seu sítio ativo foi predito, o que também eram desconhecidos. O cDNA completo do gene da Triaiisina que codifica a pró-proteína foi inserido em um vetor de expressão de proteínas de fusão pGEX-5x-3. A proteína de fusão foi expressa sob a indução de 1PTG em E. coli BL21(DE3) e purificada em cromatografia de afinidade com agarose ligada à glutationa. A proteína recombinante (rTrialisina) ativada pela saliva de T. infestans mostrou efeito citolítico sobre E. coli, T. cruzi, L donovani e células murinas da linhagem L6. A atividade fosfoiipásica A2 da ririalisina estaria relacionada com a sua atividade lítica formadora de poros. A rTrialisina foi expressa em E. coli e a proteína recombinante foi utilizada para a imunização de coelhos. Os anticorpos policlonais obtidos localizaram a expressão da proteína no primeiro par de glândulas salivares do inseto. De grande interesse, esses anticorpos inibiram parcialmente a atividade citolííica da rTrialisina in vitro. Em resumo, os resultados desse trabalho adicionam informações e insumos para a avaliação da estratégia montada pela equipe de pesquisadores do LMPDC. Nós postulamos que juntamente com outras proteínas da saliva do triatomíneo, a rTrialisina deve ser testada como fração de imunógenos na formulação de vacina polivalente visando a imposição de dificuldades ao repasto do inseto hematófago transmissor da doença de Chagas. Uma possível atividade imunobiológica ou biotecnológica da rTrialisina deverá ser avaliada após sua expressão em vetor indicado para produção em larga escala. Diante desse potencial, a aplicabilidade da rTrialisina e de outras proteínas recombinantes produzidas no LMPDC deverão ser submetidos ao processo de patente.