Uma abordagem biológica e molecular de estudos do Zucchini lethal chlorosis vírus (ZLCV), uma espécie diferenciada do grupo americano de Tospovirus

Abstract

O gênero Tospovirus pertence à família Bunyaviridae que tem como espécie tipo Tomato spotted wilt virus (TSWV). Espécies deste gênero possuem grande relevância para as hortaliças, principalmente, para as culturas do tomate e do pimentão, nas quais causam perdas significativas. Além de TSWV, várias outras espécies de Tospovirus causam perdas de impacto na produção agrícola no País, como Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) que infecta abobrinha-da-moita, melancia e melão, Groundnut ringspot virus (GRSV) em tomate, pimentão e alface, Tomato chlorotic spot virus (TCSV) em tomate e pimentão, Chrysanthemum stem necrosis virus (CNSV) em plantas ornamentais e íris yellow spot virus (IYSV) em cebola. Estas espécies apresentam um espectro de hospedeiras de tamanho relevante. A doença tipo é chamada de "vira-cabeça" e está entre os principais problemas fitossanitários em variedades destes grupos de plantas. Em cucurbitáceas a doença é denominada de amarelo letal da abobrinha-da-moita. O Zucchini lethal chlorosis virus é uma espécie que foi descrita apenas no Brasil, principalmente nas regiões produtoras de cucurbitáceas dos Estados de São Paulo e de Tocantins, infectando, especialmente, abobrinha-da-moita,melão e melancia. Em relação às demais espécies do gênero Tospovirus, ZLCV é a única que demonstra uma restrição em relação ao espectro de hospedeiras, fato este que pode estar envolvido com a proteína de movimento viral (NSm) e a proteína supressora de silenciamento gênico (NSs). Estes pontos reforçam o principal objetivo do presente trabalho que é a caracterização da proteína supressora de silenciamento NSs e um comparativo molecular desta com as demais NSs caracterizadas até o momento dentro do gênero e dentro da família do vírus. Além desse aspecto, ZLCV vem demonstrando um aumento de incidência infectando cucurbitáceas, ficando atrás apenas de Papaya ringspot virus (PRSV-W) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). Diante dessa problemática surgem mais dois objetivos no trabalho, o entendimento mais amplo em relação ao espectro de hospedeiras do vírus e o desenvolvimento de um antisoro eficiente para a diagnose do vírus. Para a caracterização molecular da NSs do ZLCV, foi utilizado um primer (Oligonucleotídeo) degenerado sentido senso que se anelou após o códon iniciador e um antisenso, que se anelou na região hairpin (em formato de grampo) do segmento S do genoma viral. Esta combinação resultou na amplificação de um fragmento de aproximadamente 2.000 pb da NSs do vírus e parte da região intergênica do segmento S, faltando apenas um pequeno fragmento para o sequenciamento total da NSs. Foi desenhado então outro primer antisenso que se anelou no início do genoma e que em combinação com o primer J13 que se anela na região consenso de todos os segmentos do genoma de vírus deste gênero, foi obtido o restante da seqüência. Comparando-se a NSs do ZLCV com segmentos correspondentes das demais espécies do grupo Americano e do grupo Euro- Asiático obteve-se identidade máxima de 73,2% com TSWV. Com base na análise de identidade e na análise fílogenética da proteína NSs de Tospovirus foi levantada a hipótese de que a restrição do círculo de hospedeiras do ZLCV poderia estar relacionada com a diferenciação de regiões da proteína NSs que tenham relação com a supressão do silenciamento. O que poderia estar causando a sua restrição em relação à infecção de novas hospedeiras. A demais é sugerida a utilização das proteínas NSs como um valor adicional na classificação das espécies do gênero Tospovirus. Para a produção do anti-soro foram imunizados dois coelhos. O anticorpo produzido apresentou reação cruzada com TCSV e GRSV, entretanto, em uma concentração de 1:500 foi possível diagnosticar a presença do ZLCV na planta e a ausência de reação cruzada. No círculo de hospedeiras foram testadas 23 diferentes cultivares de cucurbitáceas (um aumento relevante em relação aos outros ensaios já feitos de espectro de hospedeiras do vírus), além de plantas pertencentes a outras famílias como Solanaceae, Convolvulaceae, Amaranthaceae, Fabaceae e Chenopodiaceae. Foi identificada por sorologia e/ou reação da polimerase em cadeia (PCR) a presença do ZLCV em um número pequeno de plantas o que não representa uma co-evolução do vírus para à infecção de hospedeiras alternativas. O ensaio sorológico contribuirá para otimizar a diagnose viral, considerando que ZLCV vem ocorrendo em maior incidência em plantações de cucurbitáceas. O ensaio biológico e o ensaio molecular geraram informações que contribuíram ao melhor entendimento da relação patógeno x hospedeira, considerando-se que ZLCV é uma espécie dentro do gênero Tospovirus que apresenta restrição em relação a plantas hospedeiras. O entendimento dos eventos que induzem a essa restrição podem, de alguma forma, ser empregados na determinação de medidas a serem empregadas no controle das espécies de Tospovirus.