Seleção e avaliação funcional de fatores potencialmente envolvidos com interações entre plantas e nematóides parasitas

Abstract

A cultura do algodão (Gossypium hirsutum) sofre perdas significativas na sua produção, devido ao ataque de fitonematóides, especialmente o nematóide de galhas M. incognita. Visando estudar os mecanismos envolvidos na resistência, foram construídas bibliotecas de ESTs de raiz de algodão resistente e susceptível a esse nematóide. As variedades de algodão resistente (IAC 96/414) e susceptível (IAC 98/708), cedidas pelo Institituto Agronômico de Campinas em São Paulo, foram desafiadas com o nematóide de galhas com o objetivo de identificar genes expressos diferencialmente nas plantas resistente e susceptível, durante a presença do nematóide. Cada planta foi inoculada com 1.200 J2s de M. incognita, depositados homogêneamente com a pipeta ao redor da base da raiz. As raízes das plantas de cada variedade foram coletadas após 2, 4 e 18 dias após a inoculação. Essas raízes foram acondicionadas imediatamente em nitrogênio líquido e mantidas em freezer a -80 ºC até o momento da extração dos RNAs. Para a construção das bibliotecas, foi determinada a reunião dos RNAs extraídos das plantas coletadas com 2, 4, 18 dias. Ambas as bibliotecas foram desenvolvidas com o kit "Superscript Plasmid System with Gateway Technology for cDNAs synthesis and Cloning". Os cDNAs foram então seqüênciados, e a montagem das seqüências das duas bibliotecas foi realizada em conjunto, de forma a se buscar genes que estivessem sendo diferencialmente expressos. Os dados gerados resultaram em 2.262 seqüências para as bibliotecas de raíz de algodão resistente e susceptível. A montagem resultou em 1.827 grupos, sendo 234 contigs e 1.593 singlets. No presente estudo, foram identificados vários genes que podem estar associados com defesa a nematóides, outros patógenos, além de proteínas envolvidas com resposta a estresse abiótico. Esse efeito pode ser produzido pela ação do nematóide que ativa rotas de defesa no hospedeiro que levam à expressão de diversos genes de resistência (Giebel 1976; Potenza, Thomas et al. 2001; Johnk, Hietala et al. 2005). A ativação de rotas que levam à resistência do algodão ao nematóide de galhas pode ser sinalizada pela expressão de genes relacionados à resposta de hipersensibilidade (HR) no hospedeiro. Dentre essess genes, destacaram-se a chaperona Hsp90 (FL684416), superóxido dismutase (FL684415), proteína indutora de resposta de hipersensibilidade (FL684432), proteina com domínio LRR (FL684418). Esses genes já foram relacionados com o mecanismo de resistência a patógenos, que leva a ativação da resposta de hipersensibilidade nas plantas atacadas. As respectivas atividades das proteínas codificadas por esses genes serão comentadas a seguir. No início, quando a célula vegetal entra em contato com moléculas elicitoras (Avr) produzidas pelo patógeno ou pela ação do mesmo, ocorre a ativação de enzimas como NADPH-oxidases que promovem a transformação do oxigênio (O2) em íons superóxido (O-) uma espécie reativa de oxigênio, em seguida ocorre o formação e o acúmulo de peróxido de hidrogênio (H2O2) por dismutação espontânea do O- a H2O2 ou quando essa dismutação é catalisada pela enzima superóxido dismutase (SOD). Essa enzima promove a produção do H2O2 numa velocidade 1010 vezes maior que na reação espontânea. Na presença de certos íons, o H2O2 pode ser convertido em espécies de oxigênio ainda mais reativas (ROS), que se ligam a proteínas, inibem a ação de enzimas e causam danos ao DNA. Exemplo disso é a conversão do H2O2, na presença de Fe2+, para OH-, altamente tóxico. Apesar da morte celular que ocorre nas imediações das injúrias, o peróxido de hidrogênio tem um importante papel na ativação de genes de resistência vegetal que inibem a propagação na planta, da necrose provocada pela resposta de hipersensibilidade. Em seguida, à ativação dos genes de resistência ocorre a resposta sistêmica adquirida (SAR), onde várias outras microexplosões oxidativas ocorrem longe do sítio de infecção pelo patógeno, levando à propagação da expressão dos genes de resistência (Resende, Salgado et al., 2003). Relatos também indicam que a morte celular não depende apenas do peróxido de hidrogênio, mas sim da sua interação sinergistica com o oxido nítrico (Iakimova, Michalczuk et al., 2005). Sendo assim, a enzima superóxido dismutase, identificada no presente estudo, pode estar relacionada tanto com a produção da HR em combate ao patógeno, quanto à ativação de outros genes que podem ou não estar associados à resistência a M. incognita no algodão. A quinase dependente de cálcio (FL684434) é também relatada como proteína de defesa de plantas contra patógenos, pois quando ocorre um influxo de cálcio na célula vegetal, provocado por um stress, as quinases dependentes de cálcio podem iniciar uma cascata de transdução de sinal que levam a resposta de hipersensibilidade (Romeis, Piedras et al. 2000). A chaperona Hsp90 participa no dobramento de proteínas R, que atuam na defesa em resposta ao ataque de patógenos (De la Fuente van Bentem, Vossen et al. 2005). Como exemplo, a Hsp90 é essencial na resistência do tomate a M. incognita, por interação com a proteína codificada pelo gene Mi-1 (Bhattarai, Li et al. 2007). Já é sabido que os domínios LRR são freqüentes em proteínas de sinalização que atuam em mecanismos de defesa de plantas (Diévart and Clark 2004). É comum para muitos genes de resistência a nematóides o aparecimento de domínios LRR que são associados com a interação proteína proteína para o reconhecimento de moléculas Avr ou de membros da cascata de transdução de sinal que leva à resistência (Williamson and Kumar, 2006; Mehta, Magalhães et al., 2008; Fuller, Lilley et al., 2008). A proteína indutora de resposta de resposta de hipersensibilidade atua no reconhecimento do patógeno que, por fim, irá disparar o mecanismo da resposta de hipersensibilidade na planta (Rostoks, Schmierer et al. 2003). Outros genes que foram expressos na biblioteca de algodão resistente podem estar ligados à resistência a outros stresses bióticos ou abióticos, e não necessariamente estão relacionados com a resistência à nematóides. Como exemplo, podemos citar os polipeptídios reversivelmente glicosilados (FL684417) cuja função não é bem conhecida. Entretanto, um peptídeo dessa família, chamado de S1UPRG1 encontrado em plantas de tomate, interage com a proteína V1 do capsídio do geminivirus TLCV, podendo estar relacionada com uma nova via onde o polipeptídio do hospedeiro interage com a proteína V1, levando a uma interação compatível entre a planta e o patógeno (Selth, Dogra et al. 2006). As proteínas com domínios de dedos de zinco, como a seqüência encontrada na biblioteca do algodão resistente (FL684423), são fatores de transcrição que atuam na via de resposta a patógenos em diversas plantas (Park, Kim et al. 2007). A expressão do gene para a isoflavorna redutase (FL684412), pode estar relacionada com a síntese de metabólitos secundários em resposta ao patógeno. Resultados similares de expressão foram obtidos para uma cultivar resistente de alfafa (Potenza, Thomas et al. 2001). Com relação à peroxiredoxina (FL684425) esta já é uma proteína conhecida, que atua na defesa contra patógenos (Rouhier, Gelhaye et al. 2004). A proteína de resistência Brassinazole (FL684426) participa da síntese do hormônio brassinolídeo, que participa na indução da resistência em plantas (Nakashita, Yasuda et al. 2003). A proteína Skp1 (FL684427) é um componente do sistema de ubiquitina ligases que mediam a degradação de proteínas pela unidade 26S do proteossomo. A participação dessa proteína em processos de resistência de plantas já foi documentada (Kottapalli, Sarla et al. 2006). A proteína conhecida como ciclofilina (FL684428) participa no processo de sinalização para a ativação das defesas de Arabidopsis contra Pseudomonas syringae (Coaker, Falick et al. 2005). Além disso, uma ciclofilina isolada de repolho chines Brassica campestris demonstrou efeito anti-fúngico contra diversos patógenos, mas principalmente na inibição do crescimento de Botrytis cinerea (Lee, Park et al. 2007). As proteínas V-SNARE (FL684429) são proteínas de membranas que participam no processo de liberação extracelular por exocitose, de proteínas relacionadas com a resistência das plantas (Robatzek 2007). Quitinases são enzimas que atuam na hidrólise da quitina e podem estar relacionadas em processos de resistência a patógenos quitinosos, em uma série de organismos, ou no metabolismo da quitina no próprio organismo. A biblioteca do algodão resistente apresentou uma quitinase de classe IV (FL684430). Essas enzimas pertencem ao grupo das PR3, que são proteínas relacionadas à patogênese em plantas (Kasprzewska 2003). O fator despolimerizante de actina (FL684431) pode estar relacionado com o mecanismo de defesa do hospedeiro contra fungos fitopatogênicos. Esse efeito foi observado para o fator despolimerizante de actina encontrado em cevada (Miklis, Consonni et al. 2007). As enzimas do tipo endo-1,3-D-glucosidases já foram relatadas como proteínas de defesa vegetal no controle de fungos (Okinaka, Mimori et al. 1995) e de fitonematóides (Giebel 1976). A proteína dirigente de expressão já foi relacionada com mecanismos de defesa vegetal em resposta a injúrias (Ralph, Park et al. 2006). Cinnamoyl- CoA redutase (FL684435) foi apontada como uma proteína de defesa via sinalização em arroz (Kawasaki, Koita et al. 2006). Em duas recentes revisões, nos indentificamos diversas proteínas produzidas diferencialmente em plantas infectadas por nematóides (Mehta, Brasileiro et al., 2008; Mehta, Magalhães et al., 2008). As seqüências correspondentes a genes com potencial de expressão diferencial estão sendo analisadas e serão amplificadas para utilização em experimentos de Northern blotting, a fim de confirmar seus níveis de expressão experimentalmente. Posteriormente, essas seqüências poderão ser utilizadas na transformação de plantas com o intuito de produzir variedades de interesse agronômico resistentes ao nematóide. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Meloidogyne incognita is a destructive nematode responsible for heavy damage to economically important plants, including cotton (Gossypium hirsutum) the most important fiber crop worldwide. The control of this pathogen is heavily centered on chemical nematicides, which are toxic to humans and the environment, harmful to non-target organisms and expensive. Alternatively, resistant varieties of cotton obtained from conventional breeding programs represent an attractive strategy for the control of M. incognita. In this context, the aim of the work reported here was to analyze the gene expression profile of cotton plants infected with M. incognita in order to understand the mechanisms involved with resistance. EST libraries of cotton genotypes resistant to or susceptible to infection by M. incognita were constructed and sequenced, generating 2,262 sequences that were assembled into 1,827 groups (234 contigs and 1,593 singlets). The results showed genes differentially expressed in both resistant and susceptible cotton. After manual annotation, 20 genes were found to be expressed exclusively in the resistant cotton genotype, with functions related to pathogen recognition (1), signal transduction (7), defense mechanisms (10) and protein transport and activation (2). The functions of these genes acting coordinately could indicate the existence of a cotton defense pathway against 25 nematode attack. These data show the complexity in plant defense responses, and indicate some candidate genes for validation and use through transformation in other agronomically important plants.