Construção de cromossomo artificial para Komagataella phaffii

Abstract

Komagataella phaffii é reconhecida como uma plataforma de produção de proteínas heterólogas, sendo capaz de crescer a altas densidades celulares e de produzir proteínas complexas. Novas ferramentas e construções têm permitido o uso desta levedura na produção de diversos tipos de moléculas, transformando-a em uma fonte potencial de aplicações biotecnológicas. Neste campo, as vias metabólicas do organismo são modificadas com a inserção, deleção ou manipulação de diversos genes para atingir o resultado desejado. Como obstáculos à aplicação desta levedura como plataforma biotecnológica, pode-se citar a instabilidade genética, a dificuldade de se trabalhar com grandes sequências de DNA e a necessidade de novas opções de sequências regulatórias para a manipulação de vias metabólicas. As soluções para estes problemas passam pelo desenvolvimento de ferramentas que permitam uma montagem mais rápida de grandes fragmentos de DNA a fim de inserir sequências maiores e mais complexas na levedura. Neste trabalho, foram desenvolvidas novas linhagens de K. phaffii contendo duplas auxotrofias: LA3, com auxotrofia para adenina e histidina, LAU, para adenina e uracila e LAL-kan, para adenina e leucina. Vetores contendo os centrômeros nativos da levedura foram construídos e avaliados quanto à segregação mitótica e ao número de cópias na célula. Ao final, um cromossomo artificial linear foi desenvolvido e testado na linhagem LA3. O conjunto de ferramentas moleculares desenvolvido nesse projeto representa um avanço para a manipulação genética de K. phaffii. Dessa forma, vias metabólicas e sistemas de regulação serão construídos mais eficiente e rapidamente, contribuindo para que a levedura alcance seu potencial como plataforma de produção de proteínas e metabólitos.