Produção e caracterização funcional de proteínas multiepitopos e uso como insumos biotecnológicos - hepatite B e rubéola

Abstract

A Hepatite B é uma inflamação hepática causada pelo vírus HBV. O primeiro anticorpo a ser detectado após a infecção é o anti-HBc-IgM. A presença deste anticorpo possibilita a distinção da infecção atual de uma infecção passada ou remota pelo HBV, pois, após a infecção, o anti-HBc-lgM torna-se indetectável. O anti-HBc-lgG aparece logo após o IgM, alcançando rapidamente títulos elevados na hepatite aguda e permanecendo mesmo após a cura. Por ser o primeiro anticorpo presente, e algumas vezes o único marcador detectado durante a evolução da infecção, o anti-HBc pode ser usado tanto para indicar infecção aguda pelo HBV (anti-HBc-IgM) quanto para identificar indivíduos que entraram em contado com o vírus (anti-HBc-IgG). A rubéola é uma infecção causada pelo vírus RV. Geralmente, é uma doença viral leve causada na infância. A doença é de importância para a saúde pública, devido à infecção adquirida na gravidez precoce, que muitas vezes resulta em anomalias fetais, classificados como síndrome da rubéola congênita (SRC). Portanto, um diagnóstico preciso para a diferenciação da rubéola entre outras doenças infecciosas existentes com as mesmas características é imperativo para o tratamento adequado. O objetivo deste projeto é a construção de proteínas antigênicas multiepitopos recombinantes dos vírus HBV e RV, causadores de hepatite B e rubéola respectivamente, que sejam eficazes no reconhecimento de marcadores moleculares de forma que possam ser utilizados como insumos em kits de diagnóstico de hepatite B e rubéola e na produção de anticorpos monoclonais e potencial utilização para fins de pesquisa e desenvolvimento de vacinas, fármacos e medicamentos. Para o desenho da seqüência do gene MEHB (609 pb) foi feita uma busca na literatura para a seleção dos epitopos mais comuns e conservados do vírus HBV. Utilizando a mesma estratégia e com a finalidade de desenvolver uma proteína recombinante multiepitopo, denominada rMERUB, para o diagnóstico de rubéola, seqüências conservadas e imunodominantes de epitopos da região do envelope viral foram unidas. Os genes sintéticos foram clonados, com sucesso, no vetor de expressão pET21a na forma de um inserto Nde I-Xho I contendo uma sequência codificadora para uma cauda his6x tag no C-terminal. Os plasmídeos resultantes foram transformados em Escherichia coli BL21 (λDE3) pLysS. Clones selecionados foram cultivados para a indução das proteínas recombinantes, na presença de IPTG. As análises em gel SDS-PAGE mostraram bandas de indução compatíveis com o tamanho previsto da proteína multiepitopo. Foi realizado Western blot utilizando anticorpo anti-polyHistidine ainda a confirmar a identidade das bandas de indução. A purificação das proteínas foi realizada por uma única etapa por cromatografia de afinidade Ni-NTA. Foram realizados testes para comprovar a atividade imunológica das proteínas, através de ELISA foram comprovadas as reações das proteínas recombinantes com os anticorpos específicos para os respectivos vírus (HBV e RV). Este trabalho encontra-se em fase de ajustes dos testes ELISA para utilização destas proteínas na detecção dos anticorpos virais em soros de pacientes infectados, o que será feito pela empresa WAMA diagnóstica (projeto em parceria).