Efeito do uso combinado de inibidor de histona desacetilase e terapia fotodinâmica sobre o crescimento de Cryptococcus spp. in vitro

Abstract

Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico oportunista encontrado mundialmente e é capaz de causar infecções potencialmente fatais, especialmente em pessoas com imunodeficiência. Limitações para o tratamento da infecção por C. neoformans envolvem a seleção de isolados resitentes aos antifúngicos convencionais, o tempo prolongado de tratamento e efeitos colaterais como nefrotoxicidade. Abordagens alternativas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a intervenção epigenética poderiam contornar esses problemas. A TFD combina um agente fotossensibilizante (FS) não tóxico com luz vermelha e oxigênio molecular. A nanoemulsão de cloreto de ftalocianina de alumínio (NE-AlFtCl), desenvolvida por nosso grupo de pesquisa, demonstrou atividade inibitória sobre várias linhagens de células de câncer humano. Inibidores de histona desacetilase (HDACis), como o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), são frequentemente utilizados em tratamentos combinados com fármacos antineoplásicos visando a ação sinérgica e a redução de efeitos colaterais. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da TFD mediada por NE-AlFtCl, combinada a NaBut ou a TSA, sobre o crescimento de C. neoformans linhagens H99 e T1 (resistente a fluconazol) e de C. gattii NIH198. As leveduras foram cultivadas na presença de NaBut ou TSA, expostas a diferentes concentrações de NE-AlFtCl, lavadas e semeadas em placas de 96 poços para aplicação de luz no comprimento de onda de 660 nm. A incorporação do agente fotossensibilizante foi avaliada após lise celular com dimetilsulfóxido (DMSO), detecção da fluorescência no lisado por espectrofluorímetro e por microscopia confocal. A proliferação celular em resposta a diferentes tratamentos foi avaliada pela densidade óptica a 600 nm. O efeito da TFD sobre a viabilidade celular foi avaliado por meio do teste colorimétrico de brometo de 3(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e por diluição em série, seguida de semeadura em YPD sólido. O tempo de 30 min de incubação demonstrou-se suficiente para a incorporação máxima de NE-AlFtCl pelas leveduras. A microscopia confocal revelou que, em C. neoformans H99 e C. gattii NIH198, o AlFtCl se apresentou difuso pelo citoplasma. A linhagem T1 de C. neoformans apresentou menor incorporação do FS, que se concentrou na periferia celular. A TFD levou a redução da proliferação celular e essa redução foi acentuada pelo pré-tratamento das leveduras com NaBut ou TSA. A TFD demonstrou ainda citotoxicidade, dependente da concentração de FS, sobre as leveduras tratadas. O ensaio de diluição seriada demonstrou que o pré-tratamento com HDACi intensificou o efeito citotóxico da TDF. A linhagem T1 de C. neoformans demonstrou-se a mais resistente à ação de TFD em combinação com HDACi, enquanto C. gattii NIH 198 se mostrou mais sensível. Os resultados apresentados indicam a eficácia da TFD mediada por NE-AlFtCl, em combinação com o tratamento com HDACi, sobre o controle da proliferação de C. neoformans e C. gattii in vitro, podendo vir a representar uma proposta terapêutica alternativa para o tratamento de infecções fúngicas.