Pós-genoma de fungos patogênicos humanos : identificação de novas drogas contra os alvos moleculares TRR1 e KRE2 de Paracoccidioides lutzii

Abstract

A incidência e a gravidade das micoses sistêmicas têm crescido em níveis alarmantes em todo mundo. O principal fator que tem contribuído para esta casuística é o aumento de pacientes imunocomprometidos graves ou doentes de AIDS, submetidos à quimioterapia, ou terapias imunosupressoras para transplante de órgãos ou de células hematopoiéticas. Estes pacientes, além de desenvolverem formas clínicas mais severas das micoses, geralmente fatais, estão mais susceptíveis a infecções por fungos oportunistas. Em adição, a resistência às drogas atualmente disponíveis e os efeitos colaterais causados por estas terapias, apontam para a relevante necessidade de desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Por genômica comparativa foi avaliada a presença de 57 genes-alvos (55 essenciais e 2 relevantes para a sobrevivência do patógeno no hospedeiro) no genoma de nove fungos patogênicos: Paracoccidioides brasiliensis (isolados Pb18 e Pb3), P. lutzii (isolado Pb01), Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Esta análise possibilitou a seleção de 10 genes, que apresentavam características que os descreviam como potenciais alvos para drogas. Apenas dois alvos, tioredoxina redutase (TRR1) e α-1,2- manosiltransferase (KRE2), possuem estruturas tridimensionais (3D) homólogas e depositadas no banco de dados de proteínas (PDB), com identidade de sequência primária superior a 50%. Por essa razão eles foram selecionados para realização de modelagem molecular e varredura virtual. Os modelos TRR1 e KRE2 de P. lutzii (isolate 01) e as moléculas das quimiotecas Chimiotèque Nationale e Life Chemicals foram preparados para varredura virtual. O resultado do docking possibilitou a seleção de 20 moléculas contra o alvo molecular TRR1 e 34 moléculas contra KRE2, totalizando 54 moléculas potenciais, e destas 22 foram testadas quanto a suas potenciais atividades antifúngicas contra fungos patogênicos. As melhores moléculas foram F0608-0758 (contra KRE2) e F1806-0122 (contra TRR1), nas concentrações de 2PM (1Pg/mL) e 19PM (8Pg/mL), respectivamente, para o MIC50 (capacidade de inibir 50% do crescimento de fungos do gênero Paracoccidioides spp). Em paralelo, foi realizada a expressão heteróloga em Escherichia coli da enzima TRR1 de P. lutzii (Pb01), o que permitiu iniciar os experimentos de caracterização enzimática e inibição desta flavoenzima, utilizando a tioredoxina de Saccharomyces cerevisiae (Trx3) como substrato. Os valores dos parâmetros cinéticos determinados foram Km = 4,12 PM e Vmáx = 0,008 PM/s. Ensaios iniciais de inibição da TRR1, utilizando as moléculas selecionadas por varredura virtual, sugerem uma inibição competitiva sobre o alvomolecular TRR1, o que indica que a atividade antifúngica observada nos ensaios in culture contra os fungos patogênicos humanos era devido à inibição provocada especificamente sobre o sítio catlítico do alvo-molecular. Considerando uma concentração de 0,5 PM do substrato Trx3, a porcentagem de inibição da TRR1 recombinante pela droga F0876-0030 a 65 nM foi de 35%. Para a droga F1806-0122 (155 nM inibiu cerca de 30%) foi possível calcular o valor de IC50, em cerca de 310 nM de droga. Desta forma, novas moléculas com atividade antifúngicas foram identificadas e selecionadas apontando para um novo horizonte no desenvolvimento de novas drogas para o tratamento das infecções fúngicas invasivas.