Expressão heteróloga e deleção da otubaína de Trypanosoma cruzi (otutc) por intermédio do sistema CRISPR/ Cas9

Abstract

A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e transmitida por invertebrados pertencentes à subfamília Triatominae. Endêmica da América Latina, trata-se de uma doença tropical negligenciada para a qual os tratamentos disponíveis são ineficazes, exigindo, assim, novas alternativas terapêuticas. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas, estão envolvidas na regulação de diversos processos fisiológicos e, por conseguinte, têm sido objetos de estudos como potenciais alvos farmacêuticos em diversas doenças. A aplicação de CRISPR/Cas9, ferramenta biotecnológica de edição gênica, tem corroborado na elucidação do papel biológico de sequências gênicas diversas, podendo, também, ser aplicada para o entendimento do papel das sequências codificadoras para proteases. Neste contexto, este trabalho visou estudar o papel de uma cisteíno-protease do tipo otubaína mediante sua expressão heteróloga e deleção de ao menos um de seus alelos na cepa CL Brener de T. cruzi, de modo a estabelecer uma linhagem deletéria para o gene. Assim, o gene otutc foi clonado no vetor de expressão pET19b e expresso em Escherichia coli. Obteve-se, então, a otubaína recombinante (rOtuTc) purificada a partir da fração solúvel. A rOtuTc foi capaz de hidrolisar o substrato tetra-ubiquitina de origem humana (K48), sugerindo apresentar um papel de desubiquitinase. A linhagem ... de T. cruzi foi transfectada com RNA guia específico para otutc ou com cassetes indutores de recombinação homóloga no locus de interesse. Obteve-se cinco clones carreando o gene bsd, o qual confere resistêcia à marca de seleção blasticidina e que compõe um dos cassetes construídos e transfectados, sugerindo uma possível deleção de ao menos um dos alelos de otutc. Em conjunto, a obtenção tanto da proteína recombinante quanto de linhagens deletérias para otutc podem ajudar na elucidação do papel desse gene na biologia de T. cruzi, podendo despontar como um possível alvo farmacêutico para a doença de Chagas.