Desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais humanos ANTI-CD3

Abstract

O complexo CD3 está envolvido na ativação de células T durante a resposta imune, o que o torna um alvo importante para terapia imunossupressora. O anticorpo monoclonal (mAb) murino anti-CD3, OKT3, foi o primeiro mAb aprovado para uso clínico na terapia de rejeição de transplantes. Esse anticorpo foi descontinuado no início do século devido às suas características heterólogas que comprometiam a sua eficácia, já que promovia uma liberação de citocinas e ainda pelo fato de estimular o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes, numa resposta conhecida como HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies). Portanto, o desenvolvimento de novos mAbs anti-CD3 humano, com imunogenicidade e toxicidade reduzidas é importante para utilização em transplantes de órgãos e no tratamento de doenças autoimunes. O grupo de Imunologia Molecular da UnB realizou a humanização do anticorpo OKT3. Os domínios humanizados apresentaram capacidade de reconhecimento do antígeno CD3 e foram capazes de induzirem um perfil imunorregulatório em linfócitos T tratados, apesar de mostrarem uma aparente perda de afinidade, quando comparado ao anticorpo parental. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo a obtenção de novos domínios VL humanos capazes de, em conjunto com o VH humanizado, reconhecerem o antígeno hCD3. As sequências de VLs (domínios variáveis da cadeia leve) foram amplificadas por PCR a partir de uma biblioteca de genes de anticorpos humanos. Os VLs foram clonados no fagomídeo pCIg 316, vetor que permite a fusão dos scFvs à proteína III do fago M13, e sua posterior apresentação na superfície de fagos filamentosos (Phage Display). Os fagomídeos contendo um domínio de VH previamente humanizado e a biblioteca de VL no formato de scFvs, foram utilizados para transformar células eletrocompetentes de Escherichia coli, linhagem XL1-Blue. Na transformação obteve-se um total de 1x107 clones, foram escolhidos 20 clones aleatórios e a sua variabilidade foi confirmada por sequenciamento e alinhamento. As células transformadas foram utilizadas para a produção de fagos de fusão. Fagos apresentando os diferentes scFvs foram produzidos de acordo com protocolos já estabelecidos. Cinco ciclos de seleção foram realizados, utilizando-se como ligante um peptídeo sintético que contém os domínios extracelulares γε da molécula do CD3 (CD3γε) humano associados por um peptídeo conector. Os ciclos foram realizados aumentando-se sucessivamente as lavagens para eliminação dos fagos não ligados. Após a seleção, foi obtido um enriquecimento na ordem de 315 vezes. Os domínios de VLs selecionados foram amplificados por PCR e sequenciados por Next xviii Generation Sequencing (NGS). Após a análise por bioinformática, utilizando um pipeline desenvolvido pelo grupo, duas sequencias foram escolhidas para melhor caracterização. Assim, dois scFvs contendo o VH humanizado e os dois domínios de VL humanos selecionados foram construídos e clonados no vetor de expressão pET28a. Células de E. coli, da linhagem SHuffle foram utilizadas para a expressão das proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes foram obtidas a partir da fração solúvel de extratos citoplasmáticos de células induzidas. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). A capacidade de reconhecimento ao antígeno CD3γε humano foi confirmada por ELISA de ligação direta. Os resultados mostraram que as proteínas selecionadas durante o Phage display ligavam ao antígeno numa proporção maior que o controle murino (VH-VL do OKT3). Como perspectiva deste trabalho esses novos anticorpos anti-CD3 devem ser melhor caracterizados em ensaios de competição com o OKT3 e também quanto à indução de reposta imunorregulatória.