Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para aumento de síntese de ácidos graxos visando produção de biossurfactante

Abstract

A substituição de dispersantes de origem petroquímica por biossurfactantes é vantajosa por serem moléculas biodegradáveis e não tóxicas. Dentre os biossurfactantes, o ramnolipídeo é atualmente a molécula mais estudada. Estes são produzidos pela bactéria Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista com resistência natural a um grande número de antibióticos. Sendo assim o escalonamento da produção de ramnolipídeos em P. aeruginosa é oneroso por requerer inúmeras etapas de purificação. Dessa forma, o desenvolvimento de um organismo a partir de engenharia metabólica pode conduzir ao desenvolvimento de uma tecnologia livre de toxinas e com reduzidas etapas de purificação tornando o processo mais economicamente viável. Para tal, a levedura S. cerevisiae se destaca, pois tem sido amplamente utilizada na indústria alimentar, química e médica, por possuir status GRAS (do inglês Generally Regarded As Safe) e ferramentas genéticas disponíveis. Para produzir uma molécula de ramnolipídeo é necessário produzir o ácido graxo 3-(hidroxialcanoiloxi) ácido alcanóico (HAA) e o açúcar ramnose. Para cumprimento da etapa de produção de HAA, três linhagens de S. cerevisiae foram construídas visando aumentar a síntese de ácidos graxos. A primeira linhagem construída, denominada EMB51 contém os genes do complexo enzimático piruvato desidrogenase (PDHc), a segunda, denominada EMB52, os genes do complexo enzimático

acetil-CoA Carboxilase (ACC), e a terceira, denominada EMB53, os genes das enzimas ACP-S- malonil transferase, β-cetoacil-ACP sintase, e β-cetoacil redutase (Fab), que constituem metade

da via de síntese de novo de ácidos graxos. Também foi construída uma linhagem controle com o plasmídeo vazio denominada EMB50. Estas linhagens tiveram confirmação da transcrição de seus genes, foram analisadas em processo fermentativo do tipo batelada e analisadas quantitativa e qualitativamente em relação à produção de ácidos graxos através de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). As linhagens também tiveram quantificados seus compostos acetil-CoA e malonil-CoA pela técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A linhagem EMB51 foi a que mais produziu ácidos graxos, com um aumento de 16% do total. Sua velocidade de crescimento também foi alterada em 25%. A linhagem EMB52 teve a velocidade de crescimento aumentada em 35%, além de um aumento de 6% no total de ácidos graxos. A levedura EMB53 também teve uma velocidade de crescimento 50% maior, mas sem alteração no perfil produtivo de ácidos graxos. Em relação à produção qualitativa de ácidos graxos, a linhagem EMB51 produziu uma quantidade maior de ácidos graxos de cadeia curta (C10-C12), enquanto as linhagens EMB52 e EMB53 tiveram anulação de sua produção no qual foram similares à linhagem controle. Após constatação de que a linhagem EMB51 produzia mais ácidos graxos, especialmente C10 e C12, uma quarta linhagem foi construída pela inserção dos genes do complexo enzimático piruvato desidrogenase, juntamente com os genes de produção de ramnose e ramnolipídeo. Essa levedura teve seu perfil cinético analisado, não tendo uma velocidade de crescimento estatisticamente diferente, mas com sua quantificação de ácidos graxos diminuída em 20% em relação à linhagem controle. Ademais, ao aferir a produção de ramnolipídeos dessa linhagem através da técnica de LC-MS, não foi possível constatar a produção desta molécula. Sendo

assim, a maximização da produção de ácidos graxos se mostrou eficiente nas estratégias das linhagens EMB51 e EMB52, porém ao utilizar a expressão de genes codificantes de PDHc juntamente com os de produção de ramnolipídeo não mostraram eficiência para a produção e detecção desta molécula em S. cerevisiae.