Expressão heteróloga da glicoproteína do vírus da raiva por meio de vírus recombinantes

Abstract

A raiva é uma das zoonoses virais mais letais do mundo, provocando cerca de 59.000 mortes humanas todos os anos. O vírus da raiva, pertencente à família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus, possui um RNA senso negativo. É transmitido principalmente por quirópteros e carnívoros, por meio do contato da saliva dos animais infectados com feridas na pele ou mucosas. Após o período de incubação, o vírus leva a um quadro de encefalite aguda, resultando em morte em 99% dos casos. A principal forma de combate à doença adotada pela Organização Mundial da Saúde tem sido a vacinação, em especial, a de animais domésticos. Dentre as formas de prevenção da doença, a vacina oral recombinante tem sido considerada uma proposta interessante, visto que permite a vacinação de animais silvestres na forma de dispersão de iscas. É também uma alternativa mais favorável no mercado de animais de estimação, além de não apresentar riscos quanto à patogenicidade residual. Não havendo um produto nacional para esse fim, procurou-se produzir, neste trabalho, a glicoproteína G do vírus da raiva, que reveste o capsídeo do vírion, para ser utilizada como antígeno na produção de vacinas orais recombinantes. Para tanto, utilizamos células de mamífero como plataforma de expressão, dado o padrão de glicosilação complexo do antígeno. Foram testados dois carreadores virais, um adenovírus e um lentivírus, visando a expressão transiente da proteína e também o desenvolvimento de linhagens produtoras estáveis. O lentivírus, baseado no vírus da imunodeficiência humana tipo 1, apresenta o gene da glicoproteína clonado sob controle do promotor CMV. Adicionalmente, foi feita uma outra construção via overlap extension PCR a fim de produzir a glicoproteína fusionada a um domínio de ligação à celulose, visando facilitar a formulação de iscas baseadas nesse polímero. A produção de partículas virais foi realizada na linhagem 293FT, com posterior quantificação destas e transdução da linhagem 293A para verificar a produção da glicoproteína, com análise do sobrenadante e do conteúdo intracelular por SDSPAGE e western blotting 72h após a infecção. Foram identificadas uma ou mais proteínas na faixa de 65 kDa, que corresponderam ao tamanho esperado para a glicoproteína, que pôde ser identificada também no western blotting. Contudo, bandas semelhantes apareceram nos controles negativos, sendo necessária a otimização do protocolo. Já o adenovírus, baseado no sorotipo 5 humano, disponível em um vetor comercial, teria parte da região E3 substituída pelo cassete da glicoproteína G através da técnica de recombineering, utilizando o gene que confere resistência a espectinomicina 17 como marca de seleção. Com a confirmação da correta inserção e posterior remoção da marca pelo sistema Cre-Lox, o sistema seria induzido em células de mamífero, com a produção de partículas virais infectantes e a confirmação da produção da proteína feita por western blotting. No entanto, não foi possível obter clones através da técnica de recombineering, considerada a mais adequada para clonagem em uma região desfavorável, fazendo-se necessária a formulação de uma nova estratégia. O trabalho foi pioneiro na expressão heteróloga associada a carreadores virais dentro do grupo de pesquisa, podendo ser utilizado como referência para otimização em projetos futuros.