Estudos estruturais dos domínios c-terminais das septinas humanas 6, 7, 11 e 14

Abstract

Septinas são proteínas originalmente descritas em leveduras, e também presentes em humanos e outros eucariotos. Essas proteínas formam filamentos e integram o citoesqueleto, onde desempenham importante papel no estágio final da divisão celular – citocinese. Estudos apontam seu envolvimento em patologias como mal de Parkinson, Alzheimer, leucemia e outras. Cada septina humana é formada por um domínio GTP central flanqueado pelos domínios N-terminal e C-terminal. Alguns domínios C-terminais de septinas contêm regiões descritas como coiled coil que se associam com alta afinidade, no entanto o papel destas na automontagem de filamentos de septinas não está definido e nenhuma estrutura cristalográfica destas está depositada nos bancos de dados. Neste trabalho, construções contendo regiões preditas como coiled coil dos domínios C-terminais das septinas humanas 6, 7, 11 e 14 foram expressas de forma heteróloga, purificadas e submetidas a ensaios biofísicos e de cristalização, tanto separadamente quanto combinadas. Os dados de estrutura secundária obtidas por dicroísmo circular mostram que, enquanto SEPT7c adota conformações helicoidais em pH 4, 7 e 9, apenas em pH 4 as construções de SEPT11c e SEPT14c apresentam α-hélices estáveis – indicando a presença de coiled coils nestas condições, ao considerar a razão [θ]MRE 222 nm/[θ]MRE 208 nm. As análises de SEC-MALS indicaram a presença de monômeros para as proteínas analisadas individualmente, enquanto que por crosslinking químico foi possível identificar a presença de homodímeros. Além disto, as duas técnicas demonstraram a presença de heterodímeros SEPT7c+SEPT11c. Os ensaios de ultracentrifugação analítica indicaram a influência do pH para a conversão de SEPT7c de monômeros para dímeros, porém o mesmo não foi observado para as demais construções nas condições testadas. Centenas de condições de cristalização foram triadas roboticamente, assim como a variação de temperatura para favorecer a precipitação organizada das proteínas. Alguns cristais foram identificados e o espaço químico em torno das condições observadas foi explorado. Os cristais foram submetidos a ensaios de difração de raios X em difratômetro in house (D8 Venture) e também na fonte de luz Síncrotron do LNLS, contudo apenas conjuntos de dados de baixa resolução foram obtidos não permitindo a resolução das estruturas destas proteínas.