Caracterização estrutural, funcional e análise de inibição do sistema tioredoxina redutase (Trr1) – tioredoxina (Trx1) do fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans

Abstract

A criptococose é uma infecção fúngica fatal que se constitui em um problema de saúde crescente principalmente em indivíduos imunocomprometidas. As altas taxas de letalidade associadas as infecções por fungos indicam as falhas existentes nas atuais terapias, bem como o arsenal limitado de drogas com potencial antifúngico, sendo que muitas apresentam efeitos colaterais ou tóxicos. Ainda, a complexidade do tratamento pode ser atribuída em sua maior parte ao surgimento de resistência, demonstrando uma necessidade urgente de uma nova geração de agentes antifúngicos efetivos. A identificação de genes conservados essenciais necessários para o crescimento de fungos patogênicos é uma estratégia para a busca de novos alvos. Por genômica comparativa foram identificados genes ortólogos ausentes no genoma humano e presentes em fungos patogênicos humanos, entre estes, a tioredoxina redutase (Trr1), que foi selecionada como um possível candidato para a busca de novas drogas antifúngicas. Trr1 faz parte de um complexo conhecido como sistema tioredoxina, que contêm a tioredoxina (Trx), tioredoxina redutase (Trr) e o NADPH. Esta flavoenzima está localizada no citoplasma das células fúngicas e desempenha um papel crítico na manutenção do estado redox de diferentes tipos celulares. Neste trabalho foram purificadas e cristalizadas as proteínas recombinantes Trr1 e Trx1 de C. neoformans e na ausência de estruturas tridimensionais resolvidas para proteínas que participam do sistema tioredoxina em fungos patogênicos, foi determinada a estrutura 3D por cristalografia de raios X destas duas proteínas. As estruturas CnTrx1 e CnTrr1 foram resolvidas a 1,8 e 2,25 Å de resolução, respectivamente. Os resultados mostraram que CnTrx1 é um monômero em solução, estruturalmente tem um dobramento típico contendo o motivo do sítio ativo Cys-Gly-Pro-Cys conservado. Pequenas diferenças estruturais relacionadas com o seu estado oxidado e com regiões conservadas ao redor do local catalítico foram observadas quando comparadas com tioredoxinas de outras espécies. O estudo mostrou apenas mudanças menores entre CnTrx1 e Trx de Malassezia sympodialis usada como modelo. Embora as Trx tenham sido isoladas e caracterizadas em muitos organismos, essa nova estrutura 3D fornece informações importantes para a compreensão estrutural e funcional de Trx em fungos patogênicos humanos. Em relação à CnTrr1, a enzima é dimérica em solução, a massa molecular da enzima purificada por cromatografia de filtração em gel, foi estimada em cerca de 75 kDa. Além disso, observou-se que a intensidade de fluorescência da proteína diminui com o aumento da concentração de NADPH, apesar de não ter ocorrido forte deslocamento do centro de massa. Em pHs mais ácidos a enzima apresentou uma maior mudança conformacional. Em adição, os resultados de dicroísmo circular mostraram que as condições alcalinas e neutras não promovem alterações consideráveis da estrutura secundária em comparação com pHs ácidos, e a estabilidade térmica da proteína em diferentes pHs, foi maior em pH 7,0. A análise estrutural de CnTrr1 mostrou que o monômero é composto por dois domínios que formam os sítios de ligação ao FAD e ao NADPH. A distância de 2,04 Å entre os dois resíduos de cisteína mostra que CnTrr1 encontra-se na forma oxidada (FO). Como relatado em outros estudos, foi observado que o dissulfeto do sítio ativo está enterrado entre os domínios e não é acessível para o substrato. A comparação de CnTrr1 com Trr de baixa massa molecular revelou que a enzima fúngica tem loops extra na região N- e C-terminal. Adicionalmente, a obtenção do modelo CnTrr1 na forma reduzida (FR), revelou a mudança conformacional do domínio de NADPH. O modelo na conformação FR após simulação de dinâmica molecular, foi usado para construir o modelo complexado Trr1-Trx1 de C. neoformans. Os resultados mostraram que CnTrx1 interage com os dois domínios na CnTrr1, e várias interações parecem ser responsáveis pelo reconhecimento proteína-substrato em fungos. Já o estudo da atividade antifúngica in vitro com moléculas identificadas pela varredura virtual, mostrou que 2 moléculas, nas concentrações de 16 e 64 μg/mL, foram capazes de inibir o crescimento in vitro do fungo C. neoformans. Além disso, após o tratamento com essas moléculas, as células de levedura apresentaram alterações morfológicas, devido provavelmente aos defeitos de divisão celular. Embora estas moléculas não apresentaram toxicidade in vitro, a administração destas não foi capaz de reduzir a carga fúngica em tecidos dos camundongos (pulmão e cérebro). Em paralelo, foram realizados os ensaios de caracterização e inibição enzimática. Os valores dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 1,344 μM, e 0,003697 μM/s, respectivamente, enquanto que os ensaios de inibição da CnTrr1 confirmaram que as 2 moléculas foram capazes de inibir especificamente a proteína recombinante Trr1. Visando investigar a interação das moléculas na estrutura 3D de CnTrr1, as moléculas inibitórias foram submetidas aos ensaios de docking, modelagem e dinâmica molecular. Os resultados mostraram que os compostos têm afinidade de ligação pelo sítio do complexo enzima-substrato mas, também ocuparam o sítio dos cofatores. Finalmente, os estudos funcionais sobre o gene TRR1 em C. neoformans, substituindo o promotor endógeno deste gene, demostraram que este participa na regulação de alguns dos fenótipos de virulência, e está associado com a resistência a vários agentes causadores de estresse. Já o tratamento com as 2 moléculas mencionadas mostrou ligeiras diferenças na atividade inibitória da proteína Trr1. Os resultados anteriores de TRR1 evidenciam a essencialidade deste gene no crescimento fúngico in vitro, e confirmam a Trr1, como um alvo potencial para pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos contra o fungo patogênico C. neoformans.