Isolamento e cristalização de estados oligoméricos de cistatinas de plantas

Abstract

As cistatinas das plantas representam uma subfamília das cistatinas (Cys), também conhecidas como Fitocistatinas (PhyCys), sendo caracterizadas como proteínas inibidoras das enzimas cisteíno–proteases (Cys–Prot). A atividade proteica das PhyCys pode ser controlada por meio da oligomerização do tipo troca de domínios (domain swap), um evento de dimerização em que as proteínas trocam elementos de estrutura secundária, formando um dímero sem atividade inibitória. As PhyCys são inibidoras de proteases exógenas e endógenas, regulando vários processos fisiológicos como: tolerância a diferentes tipos de estresses bióticos (produzidos por fungos, bactérias e insetos) e abióticos (frio, calor e sal) tornando–as interessantes alvos de pesquisa. Os estudos das PhyCys potencializam que estas sejam ferramentas biotecnológicas aplicadas na agricultura. A presente pesquisa visou selecionar, clonar, expressar, purificar e caracterizar PhyCys. Por meio de análises, de bioinformática, em banco de dados, foram avaliadas várias PhyCys de relevância econômica, resultando na escolha de duas PhyCys, uma da Junglas regia (NOG1) e outra do Coffea arabica (CAF1). As PhyCys utilizadas nesta pesquisa foram obtidas por expressão heteróloga, utilizando as cepas de Escherichia coli (E. coli) Lemo21 (DE3) cultivadas em meio auto–indutor ZYM–5052, pois essas condições apresentaram melhor expressão solúvel de NOG1 e CAF1. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal e cromatografia de exclusão molecular (SEC). As purificações de NOG1 resultaram em maior quantidade de dímeros, contudo foram observados também monômeros, e para a CAF1 foram observados principalmente monômeros. A SEC foi utilizada em ensaios de estabilidade térmica e nos ensaios de oligomerização das PhyCys. As PhyCys foram incubadas em diferentes temperaturas (T) e as duas PhyCys se mostraram estáveis em gelo. Após incubação por diferentes períodos em intervalos discretos de 20 °C a 70 °C foi possível monitorar a conversão da forma monomérica na forma dimérica, e vice–versa. Os resultados demonstram que as mudanças no estado oligomérico das PhyCys ocorreram em função da temperatura, do tempo de incubação e da concentração. As triagens para obtenção de cristais foram realizadas com o auxilio do robô Mosquito® em diferentes condições, depois refinadas manualmente, e os cristais obtidos foram submetidos à coleta de dados de difração de raios–X in–house em um difratômetro D8 VENTURE (Bruker). Dados obtidos a 3,1 Å de resolução provenientes de cristais monoclínicos de grupo espacial C 1 2 1 da NOG1 foram resolvidos por substituição molecular. Foram observados dois dímeros por troca de domínios na unidade assimétrica.