Estabelecimento e Cultivo de Células em Suspensão e Uso de Biorreatores como Estratégias de Propagação de Bambus do Gênero Guadua

Abstract

Este trabalho teve por objetivo aperfeiçoar técnicas de multiplicação clonal in vitro de Guadua magna e Guadua aff. chaparensis, desenvolvendo estudos relacionados à calogênese, embriogênese somática e cultura de células em suspensão, além de avaliar a aplicação de biorreatores em etapas do processo. Investigações anatômicas e histoquímicas, além de análises moleculares, também foram realizadas para melhor caracterizar as diferentes etapas envolvidas nos processos estudados. Para tanto, inicialmente foi realizada a indução da calogênese em explantes formados por segmentos nodais, segmentos internodais e bainhas foliares de plantas estabelecidas in vitro de G. magna. Os explantes foram submetidos à meio de cultura de MS suplementado com dicamba, 2,4-D e picloram nas concentrações de 0; 6,77; 13,54; 20,31 e 27,08 μM. Aos 60 dias de cultivo, verificou-se que todos os tratamentos apresentaram formação de calos de coloração branco-amarelada e de aspecto mucilaginoso. A análise histológica revelou zonas meristemáticas com células em intensa divisão e formação de primórdios radiculares. As maiores percentagens de formação de calos foram obtidas nas concentrações 20,31 μM (88,0 %), 13,54 μM (85,3 %) e 27,08 μM (74,7 %). O maior incremento de massa fresca de calo foi verificado em 13,54 μM de picloram (402,5 mg). Os calos formados foram inoculados em Erlenmeyer (125 mL) contendo 20 mL de meio de MS líquido, suplementado de 4,44 μM de dicamba, 2,4-D ou picloram, onde foram avaliadas quatro diferentes origens de calos da etapa de indução de calos para o estabelecimento: 13,54 μM de dicamba (T1), 13,54 μM de 2,4-D (T2), 13,54 μM de picloram (T3) ou 20,31 μM de picloram (T4). Após seis subculturas de 30 dias cada, T3 e T4 apresentaram melhores índices de estabelecimento (100 % e 83,3 %, respectivamente), incremento da massa fresca e massa seca dos cultivos celulares em suspensão. A partir de análise citoquímica, os cultivos em T3 e T4 apresentaram aglomerados de células avermelhadas, o que as qualifica como positivas quanto à viabilidade embriogênica, conferindo à esses tratamentos as melhores condições de cultivo para tal finalidade. Num segundo capítulo, segmentos nodais de plantas cultivadas in vitro da espécie Guadua aff. chaparensis foram inoculados em meio de cultura de MS com 2,4-D e picloram, nas concentrações 11,1 μM ou 22,2 μM para indução da embriogênese somática. Após 120 dias de cultivo, foram observados quatro calos morfologicamente distintos: (1) gelatinosos em 11,1 μM de 2,4-D, (2) compactos em 22,2 μM de 2,4-D, (3) friáveis em 11,1 μM de picloram e (4) compactos nodulares em 22,2 μM de picloram. Nos calos friáveis foi observado a formação de pró-embriões, uma característica decisiva para a progressão de embriões somáticos, e também a presença de grãos de amido. Os calos friáveis foram submetidos a cultura líquida sob agitação para a obtenção de cultivos celulares em suspensão nos tratamentos T1- controle, T2- 4,44 μM de 2,4-D, T3- 4,44 μM de picloram ou T4- combinação das auxinas. Todos os tratamentos proporcionaram células com viabilidade embriogênica verificadas com a análise citoquímica, exceto T1- controle. Após o estabelecimento e a multiplicação das culturas celulares, foi realizado o restabelecimento de calos, a partir de alíquotas de 20 μL dos cultivos ressuspendidas em meio de MS nos tratamentos com 2,4-D e picloram, nas concentrações de 0; 6,77; 13,54; 20,31 e 27,08 μM. Tais calos apresentaram aspecto friável e, a partir da análise anatômica, foram observados pró-embriões somáticos. Por fim, num terceiro capítulo, realizou-se a multiplicação de propágulos vegetativos de G. magna em diferentes sistemas de cultivo in vitro: T1 MLC- Meio

Líquido Convencional; T2 MLA- Meio sob Agitação, T3 BIPER- Biorreatores de Imersão Permanente e T4 BIT- Biorreator de Imersão Temporária. Após 90 dias de cultivo, BIPER e BIT apresentaram maiores médias de sobrevivência dos propágulos em cultivo, número de brotações, altura de brotações e massa fresca, bem como conteúdo de clorofila a, b e carotenóides. A partir da análise de extravasamento de eletrólitos, foi possível verificar que em todos os tratamentos os danos à membrana foram relativamente baixos nos sistemas de cultura (≤ 33,5), exceto no T2-MLA (60,4). Na análise dos componentes bioquímicos (AST/Amido), as mudas de G. magna cultivadas em T3-BIPER e T4-BIT, consumiram em maior quantidade suas reservas de carboidratos (AST). A análise anatômica revelou a presença de regiões meristemáticas, células de primórdios foliares e radiculares, e meristema apical de caule, ou seja, que as mudas propagadas continham a estrutura celular básica necessária para o desenvolvimento de novos brotos e raízes. Também foi possível visualizar a conexão entre o sistema vascular do caule e as folhas, onde um ou mais feixes vasculares são orientados para as folhas. Quanto à aclimatização, as melhores taxas de sobrevivência foram obtidas das plantas de G. magna advindas dos tratamentos T3-BIPER e T4-BIT, com ocorrência de enraizamento adventício espontâneo. Para análise da fidelidade genética, a partir de marcadores moleculares ISSR’s, os indivíduos analisados apresentaram entre si 100 % de similaridade em todos tratamentos, e os somaclones diferiram em média menos de 0,2 %. Conclui-se que, as informações inéditas geradas neste trabalho podem ser úteis para contribuir no entendimento dos aspectos biológicos, fisiológicos e bioquímicos durante o processo de cultivo in vitro de G. magna e G. aff. chaparensis e assim também para o aperfeiçoamento da multiplicação clonal em sistemas de cultivo in vitro, inclusive para outras espécies de bambu.