Validação da cepa K2W para produção de 2’-Fucosillactose em Kluyveromyces lactis

Abstract

A 2’-fucosil-lactose (2’-FL) corresponde a cerca de 80% dos oligossacarideos presentes do leite materno (OLMs) . É um trissacarídeo neutro composto por unidades de L-fucose, D-galactose e D-glicose que se destaca por sua atividade imunomodulatoria; por atenuar processos inflamatórios ao servir como uma fibra dietética ao diminuir interações entre patógenos com a mucosa gastrointestinal em recém-nascidos. A cepa K2W foi construída utilizando a levedura Kluyveromyces lactis como plataforma biológica, pelo Laboratório de Engenharia de Biocatalisadores (LABIOCAT) da Universidade de Brasília (UnB) para produção de 2’-FL. A cepa é capaz de produzir, em tese, o oligossacarídeo 2’-FL usando como substrato lactose e hidrolisado acido seguido de tratamento enzimático provindo da semente do açaí composto majoritariamente por manose. O vetor de expressão, o plasmídeo integrativo pKLAC2 (NEB) foi usado para a inserção de três genes exógenos que codificam enzimas que viabilizam a produção de 2’-FL: manose 4,6-desidratase (gmd) e GDP-L-fucose-sintase (fcl), clonadas diretamente do genoma de Escherichia coli; e uma fusosiltransferase putativa (wcfB), produzida por síntese gênica e originária do genoma da bactéria Bacterioides fragillis. O plasmídeo final foi chamado de p2WF, contudo, além da presença de sítios de SacII que liberam as regiões de homologia do vetor para a integração ao genoma, revelou-se a existência de um terceiro sítio na região do gene gmd impossibilitando um processo de integração. Assim, o presente estudo descreve estratégias para a integração do plasmídeo p2WF no genoma da levedura K. lactis e o melhoramento do vetor de expressão para o processo de integração. As tentativas de eliminar o sítio de SacII no gene gmd foram realizadas através da técnica de mutagênese sítio-dirigida e técnicas como Montagem Gibson. Os 3 cassetes de expressão foram confirmados na cepa K2W_∆SACII, validando assim a integração genica e confirmando a construção da cepa. Estudos seguem para a detecção do açúcar.