Participação da proteína Beta-2 integrina no curso da infecção experimental induzida pelo Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo intracelular facultativo causador da Paracoccidioidomicose (PCM), doença crônica e granulomatosa, frequente na América Latina. O principal mecanismo de defesa do hospedeiro contra a PCM é a imunidade celular mediada principalmente por macrófagos ativados por IFN-γ. A interação inicial entre macrófago-fungo é mediada pelas interações entre proteínas de superfície, tais como as moléculas de adesão β2 integrinas. Os mecanismos pelos quais as integrinas interferem no curso da PCM são desconhecidos até o momento. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a participação da β2 integrina na evolução da PCM. Para isso, foram utilizados camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e geneticamente deficientes para a produção dessa proteína (β2-/-), ambos infectados com 1x106 células do isolado virulento P. brasiliensis (Pb18) por via endovenosa. Após 15, 30 e 60 dias de infecção os animais foram sacrificados e a análise histológica e histocitométrica de tecidos do fígado e pulmão foi realizada. A carga fúngica, os níveis de NO3, a concentração de anticorpos no soro e de citocinas em sobrenadante de culturas também foram determinados. Os resultados encontrados mostraram que nos camundongos β2-/- a carga fúngica foi menor quando comparada aos animais WT. No 15° dia após a infecção, tecidos do fígado de ambos os grupos de animais analisados apresentaram lesões granulomatosas bem caracterizadas; além disso, nesse mesmo período, o tamanho da área granulomatosa de tecido pulmonar foi significantemente maior nos camundongos β2-/- do que nos WT. No 60° dia após infecção, camundongos β2-/-apresentaram lesões granulomatosas mais compactas, bem formadas no tecido pulmonar, caracterizada por pouco espaço alveolar e presença de muito fungo nas lesões. Os níveis de NO3 detectados nos períodos de 15 e 60 dias após infecção foram significativamente menores em camundongos β2-/-. Os níveis de anticorpos IgG1 foram significativamente maiores em animais β2-/-. A produção de IL-12 e IL-10 foi semelhante em ambos os grupos, mas o estímulo específico com antígenos protéicos da parede celular de Pb18 induziu um leve aumento da produção apenas de IL-10. A capacidade de proliferação celular avaliada em linfócitos do baço estimulados com extrato protéico da parede celular do fungo foi mais significativa em animais β2-/-, quando comparados aos animais WT. Finalmente, foi observado que macrófagos de ambos os grupos de animais estudados, infectados in vitro com P. brasiliensis aumentaram o número de leveduras internalizadas após o tempo de 24 horas de co-cultivo. Nossos dados sugerem que as β2 integrinas participam do processo de internalização de leveduras de P. brasiliensis, contribuindo para a permanência do fungo no interior dos macrófagos e conseqüente sobrevivência do fungo. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis is a facultative intracellular fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic and granulomatous disease, frequently diagnosed in Latin America. As in other systemic mycoses, the host's principal defense mechanism against PCM is the cellular immunity mediated mainly by IFN-gamma activation of macrophages. Macrophages appear to play a fundamental role in this infection acting as the first line of defense for organism. The first interaction between macrophages-fungi is very important in this mycosis progression and this interaction is mediated by surface proteins, like β2 integrin. The role of β2 integrin in the curse of PCM is still unclear, then in the present study the importance of β2 integrin to progression of the disease was investigated. We used β2 - deficient (β2-/-) and wildtype (WT) C57BL/6 mice both endovenous infected with 1x106 the virulent P. brasiliensis strain (Pb18). After 15, 30 and 60 days post infection the mice were killed and we evaluated the disease progression by histology and histocytometry of liver and lung sections and also the fungal burden. Besides we analyzed the NO3 levels, antibodies in the serum and the production of cytokines. Our data showed that in the β2-/- mice there was less fungal burden when compared with the WT mice. After 15 days of infection, liver sections from both mouse groups presented granulomatous lesions well characterized with organized cells. Conversely, 60 days post infection we observed less alveolar space and many fungi inside the lesions in lung tissue from β2-/- mice. The size of granulomas from lung sections was significantly higher in β2-/- mice than in the WT only 15 days after infection, and this result was inverted in the 60º day post infection. Analysis of the NO3 levels from WT mice showed incresead after 8 weeks post infection; moreover IgG1a and IgG2 levels were higher in β2-/-mice. IL-12 and IL-10 production was similar in both groups, but the specific stimulus with the fungi antigens increased the IL-10 production. The spleen cell proliferation stimulated by protein extract from fungus (Pb 1:500) was more significative in β2-/- mice, while WT mice presented less efficient linfoproliferative response. We also observed that macrophages infected with P. brasiliensis in vitro from the two mouse strains had increased in internalized yeasts after 24h of co-culture. Our data suggest that β2 integrins that are probably involved with the fungi internalization contribute with the survival of the fungi inside macrophages and this phagocytosis may serve as a protected environment for the P. brasiliensis.